李潔 彭麗娜 余小燕 陳莉

1西北師范大學體育學院（蘭州 730070） 2廊坊師范學院3青海省體育科學研究所 4甘肅省蘭州市第八十二中學

低氧訓練是利用“缺氧”刺激使機體各系統(tǒng)產生抗缺氧的生理性適應，從而提高機體運輸和利用氧的能力，最終達到提高有氧代謝能力的目的［1］。低氧環(huán)境對機體的影響是多方面的。不同低氧訓練模式對血液運氧能力、組織毛細血管密度及有氧代謝酶活性的影響已見報道［2-5］。但有關不同低氧訓練模式對組織線粒體呼吸鏈功能影響的研究少見報道。腦作為神經系統(tǒng)的中樞，在機體正常生理活動過程中發(fā)揮著極為重要的調節(jié)作用。另外，腦組織幾乎不能進行糖無氧代謝，因此其線粒體氧化磷酸化的功能在腦能量合成代謝中的作用尤為重要。鑒此，本研究通過比較四種低氧訓練模式下大鼠腦組織線粒體呼吸鏈酶復合體Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ活性，探討不同低氧訓練模式對腦線粒體呼吸鏈功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗對象

雄性健康2月齡W istar大鼠50只（由蘭州大學醫(yī)學院實驗動物中心提供），體重130g左右。分籠飼養(yǎng)，每籠5只。國家標準嚙齒類動物飼料喂養(yǎng)，自由飲食飲水，室溫23±2℃左右，相對濕度50±5%，自然采光。飼養(yǎng)室、用具等定期（每周一次）用紫外燈消毒滅菌。

1.2 低壓氧艙

本實驗所用的模擬低氧環(huán)境設備是自制的低壓氧艙，采用降低環(huán)境大氣壓的辦法形成低壓低氧條件。主要用有機玻璃制成一封閉室（艙），安裝通入室內的抽氣閥和進氣閥，再與真空泵連接，啟動真空泵，不斷抽出室內氣體，造成低氣壓。操縱氣閥，調節(jié)抽氣量和進氣量的比例，造成艙內模擬高原高度3500m的低氣壓低氧環(huán)境。艙內壓力用標準海拔表校正［6］。

1.3 適應性訓練及動物篩選

（1）環(huán)境適應：大鼠購入后在動物房飼養(yǎng)2天，使大鼠適應動物房環(huán)境。（2）跑臺適應：所有大鼠在常氧（海拔1500m，大氣壓為632mmHg，氧濃度為 17.4%）條件下進行1次/天、共2天的水平跑臺適應性訓練，每次運動強度從12m/min開始遞增到18m/min，運動時間15min。使大鼠熟悉跑臺。（3）強度適應性訓練：大鼠適應跑臺后進行1次/天、共1周的強度適應性訓練，運動強度從20m/min開始，每天遞增 3m/min，最終達到 35m/min，運動時間15min。使大鼠逐漸適應正式耐力訓練的強度。（4）低氧適應：分為居住性適應和運動性適應，首先，所有大鼠進行2天低氧艙內居住適應，模擬海拔高度從2500m增至3500m（大氣壓為493mmHg，氧濃度13.6%），每天適應2h。隨后進行4天低氧遞增負荷運動適應，模擬海拔高度3500m，跑臺速度由20m/min遞增到30m/min，訓練時間由 30min遞增到 60min。（5）動物篩選：根據(jù)體重、低氧適應和跑臺運動適應情況，淘汰體重過重或過輕、低氧適應性較差和不適應跑臺運動的大鼠，保留40只大鼠進行正式實驗。

1.4 動物分組

篩選出的40只大鼠隨機分為5組（n=8）：常氧訓練組（living low-training low，LoLo）、高住高練組（living high-training high，HiHi）、高住低訓組（living high-training low，HiLo）、低住高練組（living low-training high，LoHi）和高住高練低訓組（living high-exercise high-training low，HiHiLo）。稱量各組大鼠體重。LoLo組在常氧環(huán)境進行訓練，訓練時間以外均生活在常氧環(huán)境。非訓練日24h生活在常氧環(huán)境。HiHi組在低氧（模擬海拔3500m高原，氧濃度為13.6%）環(huán)境進行訓練，訓練時間以外均生活在低氧環(huán)境中。非訓練日24h生活在低氧環(huán)境。HiLo組在低氧環(huán)境生活12h/d，在常氧環(huán)境進行訓練，訓練后生活在常氧環(huán)境。非訓練日12h生活在低氧環(huán)境，12h生活在常氧環(huán)境。LoHi組在低氧環(huán)境進行訓練，訓練時間以外均生活在常氧環(huán)境。非訓練日24h生活在常氧環(huán)境。HiHiLo組低氧環(huán)境生活12h/d，常氧環(huán)境進行訓練，另外，訓練日隔天增加一次低氧環(huán)境訓練，訓練時間以外均生活在常氧環(huán)境。非訓練日12h生活在低氧環(huán)境，12h生活在常氧環(huán)境。

1.5 訓練安排

參見文獻［7］。訓練組大鼠采用水平動物跑臺進行耐力訓練，訓練強度常氧下第1周25m/min，第 2～4周30m/min，第 5周 35m/min，低氧（氧濃度為13.6%）下第 1周 20m/min，第 2～4周 25m/min，第 5周 30m/min；持續(xù)運動時間第 1周 30min/d，第 2周 40min/d，第 3周50min/d，第4～5周60min/d；每周訓練6天。跑臺運動訓練中均使用機械刺激，未使用電刺激。

1.6 取樣及線粒體制備

各組大鼠最后一次訓練結束，均在常氧環(huán)境恢復生活72h，稱體重后，進行速度為35m/min水平跑臺力竭運動。力竭標準為［8］：大鼠跟不上預定跑臺速度，腹部與跑道面接觸，后肢蹬地無力，臀部壓在跑臺后壁，后肢隨轉動皮帶后拖達30s，毛刷刺激驅趕無效，視為力竭。力竭后即刻斷頭處死大鼠，迅速取出腦組織，置于冷生理鹽水中洗凈，濾紙吸干表面水分，置于液氮中冷凍，－20℃低溫保存待用。腦組織勻漿液及線粒體制備參照文獻［9］。

1.7 測試指標及方法

（1）線粒體呼吸鏈酶活性：參照Vyatlina的方法用分光光度法測定線粒體呼吸鏈酶復合體Ⅰ～Ⅲ活性［10］。將10～20μg線粒體蛋白加入到終體積為2m l的緩沖液中，以蒸餾水作空白管，校正光密度到0點，測定一定波長處3min光吸收值的變化。酶活性單位為μmol·mgpro-1·min-1。

（2）消光系數(shù)的測定：分別配制NADH（nicotinamide adenine dinuclectide-reduced，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸）、DCPIP（2，6-dichlorophenolindophenol，2，6-二氯酚靛酚）和 cytochrome c（細胞色素C）的濃度梯度，在一定波長處，用10mm光徑的比色杯比色，記錄消光值，做出標準曲線，標準曲線的K值為各物質的消光系數(shù)。NADH 的消光系數(shù) ε=5.022mM-1·cm-1，DCPIP 的消光 系 數(shù) ε=16.625mM-1·cm-1，cytochrome c 的 消 光 系 數(shù)ε=7.038mM-1·cm-1。

（3）蛋白濃度測定：以牛血清白蛋白為標準，考馬斯亮藍法測定。

1.8 試劑與藥品

2，3-dimethoxy-5-methyl-6-decyl-1，4-benzoquinone（DB）、NADH、rotenone、cytochrome c、antimycin 為 Sigma 公 司產品，2，6-dichlorophenolindophenol（DCPIP）為 Fluka公司產品，其余為國產分析純試劑。

1.9 主要儀器

YQ-3電動勻漿器（江蘇金壇市儀表儀器廠）、UV 754N紫外分光光度儀（上海精密科學儀器有限公司），DSPT-202型動物跑臺（中國杭州段氏制作），UNIVERSAL 32R臺式高速冷凍離心機（德國），低壓氧艙（自制），海拔表（德國）。

1.10 統(tǒng)計學分析

實驗數(shù)據(jù)均用算術平均數(shù)±標準差表示，組間比較采用SPSS13.0軟件進行One-Way ANOVA單因素方差分析，P<0.05為具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 體重變化

正式實驗前，與常氧訓練組比較，4種不同低氧訓練模式組大鼠體重均無顯著性差異（P=0.524，P=0.058，P=0.740，P=0.136）。5周實驗期結束后，5組大鼠體重較實驗前均有所增加，與常氧訓練組比較，各組均無顯著性差異（P=0.198，P=0.840，P=0.219，P=0.707）。見表1。

表1 各組大鼠體重比較（n=8）

2.2 大鼠力竭運動時間

5周不同低氧模式訓練后，與LoLo組相比，HiHi組、HiLo組和LoHi組大鼠力竭運動時間均無顯著差異（P=0.078，P=0.595，P=0.294），HiHiLo 組力竭運動時間顯著延長（P=0.040），延長19.85%。見表2。

表2 各組大鼠力竭運動時間比較（n=8）

2.3 腦組織線粒體呼吸鏈酶復合體Ⅰ~Ⅲ活性

由表3可見，與LoLo組相比，其它各組大鼠腦組織線粒體呼吸鏈CⅠ活性均無顯著變化；LoHi組CⅡ活性顯著下降（P=0.016），降低76.199%，其余各組均無顯著變化。HiHi組、HiLo組和LoHi組CⅢ活性均顯著下降（P=0.001，P=0.002，P=0.000）， 分 別 降 低 71.496% 、65.240%和 87.838%；HiHiLo組顯著上升（P=0.000），提高170.145%。

表3 各組大鼠腦組織線粒體呼吸鏈酶復合體活性比較（n=10） 活性單位：μmol·mgpro-1·min-1

3 討論

有研究報道［11］，常氧運動組、髙住高練組、高住低訓組和低住高練組大鼠實驗前體重均無顯著性差異，實驗過程中，各組大鼠體重隨著周齡的增加而增長，其中髙住高練組體重增長最慢，第4周末與常氧運動組大鼠相比具有顯著性差異（P<0.05），其余各組體重增長的規(guī)律比較一致，且無顯著性差異。本實驗中，5周不同模式運動訓練后，各組大鼠體重與訓練前相比均有所增加。與常氧訓練組相比，各組均無顯著性差異。不同低氧訓練模式下大鼠體重的變化同常氧訓練模式一致，說明低氧復合運動與常氧復合運動對大鼠體重的影響無差異。以上髙住高練組研究結果的不一致可能與運動量和低氧程度不同有關。

本實驗結果還顯示，與常氧訓練模式相比，大鼠跑臺運動至力竭的時間，HiHi組、HiLo組、LoHi組均無顯著性變化，HiHiLo組顯著延長（P<0.05），延長 19.85%，表明HiHiLo模式更有利于延長大鼠運動至力竭的時間。

已有研究表明，大鼠遞增負荷訓練7周，力竭運動后即刻，與一次力竭運動對照組相比，腦組織線粒體呼吸鏈CⅠ、CⅡ和CⅢ活性均無顯著性變化［9］。HiLo（高住低練）4周組大鼠心肌線粒體呼吸鏈CⅠ、CⅡ和CⅣ活性與常氧安靜對照組相比顯著升高（P<0.05或P<0.01），CⅢ活性無明顯變化［12］。以上研究說明低氧訓練可影響機體組織線粒體呼吸鏈酶活性。

本實驗結果顯示，與常氧訓練組比較，HiHi組和HiLo組腦組織線粒體呼吸鏈CⅠ和CⅡ均無顯著變化，CⅢ活性均顯著性下降（P<0.01），分別下降71.496%和65.240%。LoHi組CⅠ活性無顯著變化，CⅡ和CⅢ活性均顯著下降（P<0.05，P<0.01），分別下降 76.199%和87.838%。由于CⅢ是電子傳遞鏈的限速步驟［13］，其活性降低必將影響呼吸鏈的功能，進而影響ATP的合成能力，因此，HiHi、HiLo和 LoHi在改善腦線粒體呼吸鏈功能方面與常氧訓練比未見優(yōu)勢。HiHiLo組CⅠ和CⅡ均無顯著變化，CⅢ活性均顯著升高（P<0.01），提高170.145%，升高幅度較大。這提示HiHiLo模式較常氧訓練具有顯著提高腦線粒體電子傳遞鏈功能的效果。已有研究表明HiHiLo訓練手段對血象指標和有氧運動能力的影響效果好于LoHi，尤其在賽前大負荷訓練期間應采用 HiHiLo 模式［14］。

4 總結

就本研究建立的模擬海拔3500m高度的四種低氧訓練模式來說，髙住高練低訓比常氧訓練具有顯著提高線粒體電子傳遞鏈功能的效果，髙住高練、高住低訓和低住高練在改善線粒體呼吸鏈功能方面與常氧訓練比未見優(yōu)勢。

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