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        補(bǔ)充香菇多糖對長期大負(fù)荷運(yùn)動小鼠免疫調(diào)節(jié)作用

        2010-11-17 11:21:36史亞麗蔡德華王曉潔杜蓉
        關(guān)鍵詞:小鼠劑量血清

        史亞麗 蔡德華 王曉潔 杜蓉

        1魯東大學(xué)體育學(xué)院(煙臺 264025) 2魯東大學(xué)食用菌工程研究中心 3魯東大學(xué)生命科學(xué)院

        香菇(Lentinus edodes)含有多種有效藥用組分,尤其是香菇多糖(Lentinan,LNT)。它是一種重要的生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑,通過刺激免疫細(xì)胞成熟、分化和增殖,改善宿主機(jī)體平衡,達(dá)到恢復(fù)和提高宿主細(xì)胞對淋巴因子、激素和其它生理活性因子的反應(yīng)性[1,2]。LNT對提高運(yùn)動機(jī)體免疫力方面的研究尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)對長期進(jìn)行大負(fù)荷運(yùn)動小鼠灌胃LNT,觀察補(bǔ)充LNT對運(yùn)動小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力、血清抗體相對含量及體外抗體形成細(xì)胞數(shù)量(體液免疫)的影響,探討補(bǔ)充LNT對長期大負(fù)荷運(yùn)動小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用,為其作為運(yùn)動營養(yǎng)補(bǔ)品的研究開發(fā)提供依據(jù)。

        1 材料和方法

        1.1 實(shí)驗(yàn)動物

        清潔級昆明種小鼠120只,雄性,18~22g,山東綠葉制藥股份有限公司實(shí)驗(yàn)動物中心提供,動物合格證號:SYXK(魯)20030020。一級白色豚鼠,體重 300~400g,山東中醫(yī)藥大學(xué)提供,動物合格證號:SCXK(魯)20050015。小鼠分籠飼養(yǎng),每籠5只,自由飲食,國家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動物常規(guī)飼料喂養(yǎng)。動物飼養(yǎng)環(huán)境23℃±2℃,濕度40%~60%,自然晝夜節(jié)律。

        1.2 動物分組與處理

        120只小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3天后,隨機(jī)分為安靜對照組(C)、運(yùn)動組(T)、鹽水 +運(yùn)動組(S+T)、高劑量 LNT+運(yùn)動組(HL+T)、中劑量 LNT+運(yùn)動組(ML+T)、低劑量LNT+運(yùn)動組(LL+T),每組20只。實(shí)驗(yàn)后期死亡14只,T組死亡 3只,S+T組 4只,HL+T組 2只,ML+T組 2只,LL+T組3只。灌胃及訓(xùn)練結(jié)束后將每組小鼠隨機(jī)分為a、b兩小組,a小組進(jìn)行巨噬細(xì)胞吞噬功能的測定,b小組用作血清凝集效價(jià)(抗體相對含量)測定及體外抗體形成細(xì)胞數(shù)量測定。

        1.2.1 運(yùn)動條件

        塑料游泳池,100cm×60cm×50cm,水深40cm,超過小鼠體長2倍,水溫32~34℃。

        1.2.2 訓(xùn)練方案

        C組:不進(jìn)行運(yùn)動訓(xùn)練,只進(jìn)行正常的生理活動。T、S+T、HL+T、ML+T、LL+T各組小鼠進(jìn)行 5%負(fù)重游泳訓(xùn)練,持續(xù)4周,6次/周,周日休息。第一周從20min開始負(fù)重游泳,以后每日增加5min直至45min/日,運(yùn)動時(shí)間不足45min就發(fā)生力竭的小鼠迅速撈起,擦干身體休息5min后再放入水中繼續(xù)游泳,訓(xùn)練時(shí)間累計(jì)須達(dá)到45min/次。訓(xùn)練結(jié)束后,迅速用電吹風(fēng)吹干身體。

        1.3 補(bǔ)充方法

        1.3.1 香菇多糖的提取

        香菇由魯東大學(xué)食用菌工程研究中心提供。子實(shí)體50℃烘干、粉碎、稱重、熱水浸提、過濾、濾液醇沉得多糖[3]。多糖含量測定方法參照文獻(xiàn)[3]。

        1.3.2 補(bǔ)充方法

        采用灌胃法,HL+T組每日劑量400mg/kg,ML+T組200mg/kg,LL+T組 100mg/kg。用生理 鹽水 配制 成400mg/10ml、200mg/10ml、100mg/10ml的 LNT 鹽水溶液,每日0.2ml劑量灌胃,S+T組灌胃等體積生理鹽水。1次/d,時(shí)間為4周。

        1.4 指標(biāo)測定

        1.4.1 巨噬細(xì)胞吞噬功能的測定

        可溶性淀粉6g加入肉湯培養(yǎng)液100ml中,混勻,煮沸滅菌備用。a小組每只小鼠腹腔注射6%可溶性淀粉,1ml/只,當(dāng)日停止訓(xùn)練,繼續(xù)灌胃。3日后于小鼠腹腔注射5%雞紅細(xì)胞懸液0.2ml,輕柔腹部,注射后30min于小鼠腹腔注射生理鹽水1ml,輕柔腹部數(shù)次。采集腹水:取小鼠自然站立位。在恥骨前緣,腹中線兩側(cè)剪毛、消毒,浸潤麻醉,緊繃穿刺部位皮膚,作垂直穿刺。用注射器慢慢回抽,滴1滴于潔凈載玻片上,推成薄片,晾干后甲醇固定4~5min。滴加瑞士-吉姆薩染液,染色3min,流水沖洗,自然晾干,油鏡下觀察。隨機(jī)計(jì)數(shù)100個巨噬細(xì)胞,記錄并計(jì)算吞噬率和吞噬指數(shù)。吞噬指數(shù)=100個巨噬細(xì)胞所吞噬的雞紅細(xì)胞總數(shù)/100;吞噬率=100個巨噬細(xì)胞中吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)/100×100%[4]。

        1.4.2 血清凝集效價(jià)(抗體相對含量)和體外抗體形成細(xì)胞(PFC)測定(脾臟溶血空斑形成)

        于灌胃及訓(xùn)練結(jié)束前第4天,b小組每只小鼠腹腔注射5%SRBC懸液0.2ml致敏,以生成抗體形成細(xì)胞及產(chǎn)生抗體,繼續(xù)灌胃及訓(xùn)練。

        (1)血清凝集效價(jià)(抗體相對含量)測定:灌胃及訓(xùn)練結(jié)束后,將b小組小鼠頭朝下,斷頸采血,血液37℃水浴放置2h,轉(zhuǎn)入冰箱放置2h,分離血清,進(jìn)行抗體凝集反應(yīng)[4],測定血清凝集效價(jià)。

        (2)體外抗體形成細(xì)胞(PFC)測定:按文獻(xiàn)[5]制備豚鼠血清。將b小組小鼠脾臟用生理鹽水制成1×107/ml脾細(xì)胞懸液,取0.1ml脾細(xì)胞懸液和5%SRBC懸液,迅速保溫于47℃水浴中的3.5ml濃度為0.7%瓊脂糖管內(nèi),搖勻后立即將混合物傾入鋪有底層瓊脂糖凝膠的平皿內(nèi),輕搖使其鋪開,待瓊脂凝固后,37℃孵育1h。每皿加入 1∶10稀釋的豚鼠血清2ml為補(bǔ)體,使其均勻覆蓋表面。37℃孵育30min,室溫放置1h,4℃冰箱過夜,次日傾去補(bǔ)體,低倍鏡下觀察,空斑中央為淋巴細(xì)胞,周圍為透明區(qū)。計(jì)數(shù)每皿空斑數(shù),單位為個/106脾細(xì)胞[4]。

        1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

        2 結(jié)果

        2.1 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力

        4周大負(fù)荷的運(yùn)動訓(xùn)練后,T組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬率、吞噬指數(shù)較C組明顯降低。中、高劑量LNT+運(yùn)動組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬率顯著高于鹽水+運(yùn)動組和低劑量LNT+運(yùn)動組,中劑量LNT+運(yùn)動組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬指數(shù)顯著高于鹽水+運(yùn)動組和低劑量LNT+運(yùn)動組。

        表1 各組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力比較

        2.2 小鼠血清凝集效價(jià)、體外抗體形成細(xì)胞數(shù)量

        4周大負(fù)荷的運(yùn)動訓(xùn)練后,T組血清凝集效價(jià)、體外抗體形成細(xì)胞數(shù)較C組明顯降低。低、中、高劑量LNT+運(yùn)動組小鼠血清凝集效價(jià)均顯著高于鹽水+運(yùn)動組,中劑量LNT+運(yùn)動組小鼠血清凝集效價(jià)顯著高于低劑量LNT+運(yùn)動組;中劑量LNT+運(yùn)動組小鼠體外抗體形成細(xì)胞數(shù)顯著高于鹽水+運(yùn)動組和低劑量LNT+運(yùn)動組。

        表2 各組小鼠血清凝集效價(jià)、體外抗體形成細(xì)胞數(shù)量比較

        3 討論

        運(yùn)動訓(xùn)練對免疫系統(tǒng)及其功能的影響可歸納為兩方面:急性短時(shí)中等強(qiáng)度運(yùn)動激活免疫系統(tǒng)并提高免疫功能,長時(shí)間耐力運(yùn)動或長期強(qiáng)化性訓(xùn)練則抑制免疫功能[6]。力竭運(yùn)動可抑制腹膜巨噬細(xì)胞MHCⅡ的表達(dá),進(jìn)而影響巨噬細(xì)胞的抗原呈遞作用,抑制巨噬細(xì)胞的功能[7,8]。大強(qiáng)度運(yùn)動后B細(xì)胞合成和分泌免疫球蛋白的功能出現(xiàn)明顯改變,以75%VO2max強(qiáng)度運(yùn)動1h,合成與分泌IgG、IgA、IgM等免疫球蛋白的細(xì)胞功能在運(yùn)動過程中和運(yùn)動結(jié)束后明顯降低[6]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,運(yùn)動組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬率、吞噬指數(shù)、血清凝集效價(jià)、體外抗體形成細(xì)胞數(shù)量均顯著低于對照組,表明長期大負(fù)荷運(yùn)動小鼠處于運(yùn)動性免疫抑制狀態(tài)。

        LNT是一種免疫激活劑,能激活巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞,提高巨噬細(xì)胞的趨化性和淋巴細(xì)胞對Yac-1細(xì)胞和P-815細(xì)胞的毒性反應(yīng)水平[9]。香菇是誘生α-干擾素較明顯的一種真菌,LNT能活化CD4+淋巴細(xì)胞,促使CD4+增殖和IL-2R表達(dá)[10]。LNT可活化T細(xì)胞,并對免疫巨噬細(xì)胞起誘導(dǎo)和增強(qiáng)作用,使免疫狀態(tài)由低下恢復(fù)到接近于正常。本研究結(jié)果顯示,補(bǔ)充中、高劑量LNT均可使長期大負(fù)荷運(yùn)動小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞吞噬率明顯提高,中劑量LNT可使長期大負(fù)荷運(yùn)動小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)升高且效果明顯好于低劑量LNT。低、中、高劑量LNT均可使長期大負(fù)荷運(yùn)動小鼠血清凝集效價(jià)明顯提高,中劑量LNT效果明顯好于低劑量LNT,中劑量LNT可明顯提高長期大負(fù)荷運(yùn)動小鼠體外抗體形成細(xì)胞數(shù)且其效果明顯好于低劑量LNT。

        綜上,4周大負(fù)荷運(yùn)動可以導(dǎo)致小鼠運(yùn)動性免疫抑制。補(bǔ)充LNT可使長期大負(fù)荷運(yùn)動小鼠非特異性及特異性免疫功能得到改善,其中,中劑量LNT補(bǔ)充效果明顯。

        [1]芳積年,王順春.香菇多糖的研究進(jìn)展.中國藥學(xué)雜志,1997,3(6):332-334.

        [2]劉棟,錢建亞,卜敏.香菇多糖抗腫瘤作用研究現(xiàn)狀.中國食用菌,2002,22(2):6-7.

        [3]張惟杰.復(fù)合糖生化技術(shù).上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社,1987.13-15.

        [4]司傳平.醫(yī)學(xué)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn).北京:人民衛(wèi)生出版社,2005.15-17,71-72,74-76.

        [5]吳端生,張建.現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)動物學(xué)技術(shù).北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2007.285-286.

        [6]張愛芳.實(shí)用運(yùn)動生物化學(xué).北京:北京體育大學(xué)出版社,2005.378.

        [7]Ceddia MA,Woods JA.Exercise suppresses macrophage antigen presentation.J Appl Physiol,1999,87(6):2253-2258.

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        [9]Kurashige S,Akuzawa Y,Endo F.Effects of Lentinus edodes,Grifola frondosa and Pleurotus ostreatus’administration on cancer outbreak,and activities of macrophages and lymphocytes in mice treated with a carcinogen,N-butyl-N’-butanolnitrosoamine. Immunopharmacol Immunotoxicol,1997,19(2):175-183.

        [10]萬克青.香菇多糖注射液對慢性活動型肝炎外周血T淋巴細(xì)胞亞群和IL-2R表達(dá)作用的研究.中國免疫學(xué)雜志,1995,11(5):298-299.

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