王維霞 許永國 王秀穎 周大慶 （山東省諸城綠安檢測有限公司 262200）

氟喹諾酮類藥物(Fluoroquinnolones，FQs)是近年來發(fā)展迅速并被廣泛應用的新一代全合成抗生素。它抗菌譜廣、高效、低毒、組織穿透力強，抗菌作用是磺胺類藥的近千倍，與第3代頭孢類抗生素相媲美。由于FQs是化學合成藥物，價格低廉，故在醫(yī)學和獸醫(yī)學中應用廣泛。在畜禽和水產養(yǎng)殖中，FQs主要用于治療、預防和促生長。因其在體內代謝緩慢易殘留，且致病菌產生耐藥性和某些FQs的潛在致癌問題，其殘留問題越來越引起人們的廣泛關注。2006年日本肯定列表中嚴格規(guī)定了氟喹諾酮類藥物檢出限量，其中對沙拉沙星限量要求最高達0.01ug/kg，其次諾氟沙星也高達0.02μg/kg 。

目前，用于FQs殘留檢測的方法有微生物法、氣相色譜法、氣相色譜-質譜法、高效液相色譜法、液相色譜-質譜法、免疫分析法等。但在現行國內標準和報道文獻中常用的高效液相色譜法只能檢測2、3種藥物殘留，本研究采用液液萃取進行樣品前處理，用帶熒光檢測器的液相色譜儀梯度洗脫檢測，可同時測定氧氟沙星(OFLX)、諾氟沙星(NOR)、恩諾沙星(ENR)、環(huán)丙沙星(CIF)、達氟沙星(DAN)、雙氟沙星(DIF)、沙拉沙星(SRA)。本方法靈敏度高、準確、簡單、快速，還有重現性好、檢測成本低的特點。

1 材料與方法

1.1 儀器

美國WATERS公司高效液相色譜儀，配有2475熒光檢測器，1525二元泵，WATERS SymmetryShieldTMRP18色譜柱；美國Milli-Q純水儀；日本柴田 HW2B-20/20旋轉蒸發(fā)器；上海安亭離心機LD5-2A；北京醫(yī)用高速離心機LG16-W。

1.2 試劑和材料

乙腈、甲醇、正已烷均為色譜純；氫氧化鈉、磷酸、三乙胺、正丙醇為分析純；純水。氟喹諾酮類標準物質：氧氟沙星、諾氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、達氟沙星、雙氟沙星、沙拉沙星標準品，純度≥98%，日本關東株式會社生產。

1.3 色譜條件

色譜柱：WATERS SymmetryShieldTMRP18 4.6mm×250mm，5um；保護柱：柱溫：38℃；流動相A：0.05mol/L磷酸三乙胺緩沖液(pH3.0)-乙腈(88+12)B：0.05mol/L磷酸三乙胺緩沖液(pH3.0)-甲醇(70+30)；波長：激發(fā)波長280nm，發(fā)射波長450nm；進樣量：20μl；流速0.8ml/min梯度表為：

時間(min) 0 3 9 17 19 24流動相A(%) 100 100 0 0 100 100流動相B(%) 0 0 100 100 0 0

1.4 樣品的制備

稱取3.0g絞碎的樣品于100ml離心管中，加入20ml氫氧化鈉溶液(pH=12)－乙腈(1+19)提取液，15000r/min均質1min，3000r/min離心5min，將上清液倒入已加入25ml乙腈飽和正己烷溶液的100ml分液漏斗中，振搖5min，靜置分層；收集下層于100ml雞心瓶中，用20ml提取液洗刀頭，把洗刀頭液加入殘渣中，渦旋混勻1min，超聲5min，3000r/min離心5min，將上清液合并于分液漏斗中，振搖5min，靜置分層；收集下層合并于雞心瓶中，加10ml正丙醇，40℃水浴旋轉蒸發(fā)至干；加入1.0ml流動相A溶解殘渣，超聲5min；移入1.5ml離心管中；加入0.5ml乙腈飽和正己烷溶液，12000r/min離心5min，若下層混濁除去正己烷層后重復加入乙腈飽和正己烷離心，直至變清為止，用2ml 1次性注射器吸取下層溶液，用0.45μm濾膜過濾，供HPLC分析。

1.5 測定

1.5.1 標準工作曲線的制備 準確稱取7種標準品各10.0mg，分別加于7只100ml棕色容量瓶，用0.03mol/L氫氧化鈉溶液溶解定容至刻度，即成100μg/ml標準儲備液。于2～8℃中保存3個月。吸取達氟沙星0.2ml外其余標準儲備液各1.0ml于100ml的棕色容量瓶中，用流動相A定容至刻度，即成1.0(dan0.2)μg/ml標準混合中間工作液. 分別吸取標準混合中間工作液2、5、10、50、100、200μl，用流動相A定容至刻度，稀釋成濃度分別為0.002、0.005、0.01、0.05、0.1、0.2μg/ml，達氟沙星濃度為0.0004、0.001、0.002、0.01、0.02、0.04μg/ml的標準工作曲線。

1.5.2 樣品空白和空白添加回收試驗 每個批次試驗中，均做1個空白樣品和1個空白樣品添加回收?？瞻讟悠诽砑恿繎扔谧畲髿埩粝蘖?，或方法定量限遠優(yōu)于最大殘留限量時，應選在等于方法定量限上。本方法添加回收選在要求最嚴的最大殘留限量0.01μg/g試驗回收不僅用于對陽性殘留結果的校正還可考量每批次檢測的可靠性。

1.5.3 結果計算 陽性樣品結果計算根據樣品與標準色譜圖比較，選用峰響標準樣品濃度單點校正，按：C=計算。C－樣品中對應的每一種沙星的殘留量(μg/g)；V－最終定量體積數(ml)；A－樣品溶液中對應的每一種沙星色譜峰面積；A0－空白樣品溶液中對應的每一種沙星色譜峰面積；AS－標準工作液中對應的每一種沙星的峰面積；CS－標準工作溶液中對應的每一種沙星的濃度(μg/ml)；m－樣品重量(g)；R—樣品回收率。

1.5.4 方法的靈敏度、準確度和精密度 靈敏度：本方法的禽肉組織中達氟沙星的定量檢出限為0.001μg/g，氧氟沙星、沙拉沙星、諾氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、雙氟沙星定量檢出限均為0.005μg/g。準確度和精密度：本方法在0.01μg/g添加水平下樣品的回收率范圍82%～94%，RSD＜10%。

2 結果與討論

2.1 色譜柱的選擇

在FQs的HPLC分析中標準和文獻中大多采用反相色譜柱，如C18、C8等，因此選用相對成熟的C18柱，WATERS SymmetryShieldTMRP18色譜柱硅膠表面具有良好的低活性，分離度好，峰型尖銳。

2.2 流動相的選擇

根據標準和文獻報道比較，采用磷酸緩沖溶液作流動相可以得到良好的峰型，經使用農業(yè)部236號公告的磷酸緩沖溶液分析效果較好，但保護柱和色譜柱的使用壽命較短，參考色譜耐酸堿度和文獻報道，把pH2.4調為pH3.0，經長期驗證，分析效果基本相同，保護柱和色譜柱使用壽命延長1倍多。由于雙氟沙星和沙拉沙星主要基團相似而分離不開，出峰時間在30min，分析時間長，故加入只對雙氟沙星和沙拉沙星溶解度差別大的甲醇來調節(jié)。經試驗用0.05mol/L磷酸三乙胺緩沖液(pH3.0)-乙腈-甲醇(83+10+7)完全分離最好，出峰時間在28min，分析時間長，不理想。為減少分析時間，采用梯度洗脫，經大量實驗驗證選用0.05mol/L磷酸三乙胺緩沖液(pH3.0)-甲醇(70+30)梯度洗脫在20min內可完全分離，全部運行時間為24min。見圖1。

圖1 7種氟喹諾酮混合標準品的色譜圖

2.3 樣品前處理條件的優(yōu)化

FQs的前處理方法國內外報道很多.采用酸性或堿性有機相提取都有較好的回收率，但采用液液萃取蒸發(fā)濃縮，時間較長又不易蒸發(fā)至干。參考NY/TDJ320-2001檢驗技術規(guī)程和《獸藥殘留分析》，對較難蒸發(fā)的磷酸鹽堿性乙腈提取液調為氫氧化鈉溶液堿性乙腈，為保證堿度和禽肉組織足夠用量，經大量實驗驗證，氫氧化鈉溶液(pH=12)－乙腈(1+19)提取液滿足要求。7種氟喹諾酮的回收率均在70%以上，提取效果好。

2.4 方法的線性范圍和檢出限

用1.0(dan0.2)μg/ml標準混合中間工作液，稀釋成濃度分別為0.001、0.002、0.005、0.01、0.05、0.1、0.2μg/ml，達氟沙星濃度為0.0002、0.0004、0.001、0.002、0.01、0.02、0.04μg/ml的標準工作曲線。線性關系見表1。

當添加7種氟喹諾酮，達氟沙星0.0004μg/g，氧氟沙星、沙拉沙星、諾氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、雙氟沙星均為0.002μg/g時，色譜圖信噪比大于3，故以此作為方法的檢出限。見圖2～3。

圖2 空白樣品的色譜圖

圖3 樣品添加達氟沙星0.0004μg/g，氧氟沙星、沙拉沙星、諾氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、雙氟沙星均為0.002μg/g時的色譜圖

當添加7種氟喹諾酮，達氟沙星0.001μg/g，氧氟沙星、沙拉沙星、諾氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、雙氟沙星均為0.005μg/g時，色譜圖信噪比大于10，故以此作為方法的定量限。見圖4。

2.5 方法的準確度和精密度

圖4 樣品添加達達氟沙星0.001μg/g，氧氟沙星、沙拉沙星、諾氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、雙氟沙星均為0.005μg/g時色譜圖

分別以雞肉和鴨肉做添加回收實驗，分別添加0.002、0.01、0.2μg/g，(DAN0.0004、0.002、0.04)3個濃度水平七種氟喹諾酮的混合標樣，每個濃度雞肉和鴨肉各做3個平行試驗，試驗結果見表2～4。

表2 樣品添加0.002(0.0004)μg/g的7種氟喹諾酮的試驗結果 (%)

表3 樣品添加0.01(0.002)μg/g的7種氟喹諾酮的實驗結果 (%)

表4 樣品添加0.2(0.04)μg/g的7種氟喹諾酮的實驗結果 (%)

3 結論

本研究建立了可同時檢測禽肉中7種氟喹諾酮類藥物的方法。它靈敏度高、準確、簡單、快速，還有重現性好、檢測成本低，可幫助出口日本歐盟企業(yè)用于禽肉中的氟喹諾酮類藥物檢測。

[1]肉及肉制品中恩諾沙星殘留檢驗技術規(guī)程NY/TDJ320-2001.

[2]農業(yè)部第236號公告. 動物性食品中恩諾沙星和環(huán)丙沙星殘留檢測方法-高效液相色譜法[S]. 2003.

[3]農業(yè)部781號公告. 雞蛋中氟喹諾酮類藥物殘留量的測定高效液相色譜法[S]. 2006.

[4]李俊索, 邱月明, 王超等. 獸藥殘留分析[M]. 上?？茖W技術出版社,2002: 228-264.