伍 藝

(重慶市婦幼保健院 400013)

宮頸癌是嚴(yán)重危害婦女健康與生命的常見(jiàn)病，居女性癌癥死亡第2位，占女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的首位。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究表明，宮頸上皮腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后與多種基因的變化密切相關(guān)。

近年來(lái)的研究表明，Bmi-1在胃癌、結(jié)腸癌[1-2]、肺癌、乳腺癌[3]等多種腫瘤中均有高表達(dá)[4]。p16基因又稱多腫瘤抑制基因(multipie tumorsuppressor，M TS1)，是繼 p53 基因之后的又一重要的抑癌基因[5]。近年來(lái)的研究表明在多種腫瘤中p16基因表達(dá)降低，如乳腺癌[6]、食管癌[7]、胃癌[8]，大腸癌。有研究表明在一些腫瘤中有Bmi-1基因表達(dá)增高并同時(shí)伴有p16基因的低表達(dá)。研究者發(fā)現(xiàn)Bmi-1基因與p16蛋白在小鼠淋巴瘤的發(fā)生過(guò)程中起協(xié)同作用。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)Bmi-1 m RNA的表達(dá)水平在大腸癌組織中較癌旁組織顯著升高，高表達(dá)的組織中p16蛋白明顯低表達(dá)[9]。

但有關(guān)Bmi-1、p16與宮頸腫瘤關(guān)系的研究較少，本研究旨在檢測(cè)Bmi-1基因和p16基因在正常宮頸、宮頸上皮腫瘤、宮頸癌中的表達(dá)水平，探討二者在宮頸腫瘤中表達(dá)的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 87份宮頸組織標(biāo)本均來(lái)自本院2008～2009年子宮頸活檢和手術(shù)切除的病理標(biāo)本。年齡23～68歲，平均43.3歲。經(jīng)病理證實(shí)正常宮頸上皮組織7例，CINⅠ級(jí)10例，CINⅡ級(jí)21例，CINⅢ級(jí)及原位癌組織17例，宮頸癌組織32例。均未做化學(xué)、免疫及放射治療。

1.2 試劑與方法 鼠抗人Bmi-1單克隆抗體、鼠抗人p16單克隆抗體、羊抗鼠IgG均購(gòu)自Santa Cruz公司。免疫組織化學(xué)SP試劑盒，購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、EC L發(fā)光試劑盒均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所。免疫組化SP法按試劑盒要求進(jìn)行操作。用已知陽(yáng)性切片作陽(yáng)性對(duì)照，PBS代替一抗作陰性對(duì)照。Western blot檢測(cè)，于4℃下，取宮頸癌組織及癌旁組織各 0.5～1.0 g，加入裂解緩沖液，粉碎勻漿后，4℃靜置 24 h，再于 4℃下 12000 r/min離心 20 min，提取總蛋白，并進(jìn)行蛋白定量。經(jīng)10%SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)印、5%脫脂奶粉封閉，Bmi-1(1∶1000)、p16(1∶1000)4℃下孵育過(guò)夜;二抗(1∶5000)室溫下孵育2 h，EC L顯色。

1.3 結(jié)果判斷 免疫組化結(jié)果:Bmi-1陽(yáng)性表達(dá)定位于細(xì)細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色為染色陽(yáng)性細(xì)胞。p16陽(yáng)性同樣定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，胞核或胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞。空白陰性對(duì)照的細(xì)胞不顯色，陽(yáng)性對(duì)照的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)呈黃色、棕黃色或棕褐色。具體分類依染色細(xì)胞數(shù)及強(qiáng)弱而定，著色強(qiáng)度:無(wú)色(-)定為0分、淺黃色(+)定為1分、黃色及更深顏色(++)定為 2分;陽(yáng)性細(xì)胞數(shù):≤50%為定0分，＞50%～75%定為1分，＞75%定為2分。兩項(xiàng)得分相乘結(jié)果大于或等于2定為陽(yáng)性。Western blot檢測(cè)結(jié)果經(jīng)自動(dòng)電泳凝膠成像分析儀進(jìn)行，并進(jìn)行灰度值測(cè)定。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，進(jìn)行χ2檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Bmi-1及p16蛋白在各宮頸組織中的表達(dá) p16及Bmi-1在正常子宮頸組織、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ及原位癌、子宮頸癌組織中表達(dá)的陽(yáng)性率見(jiàn)表1。由表1可見(jiàn)，Bmi-1蛋白的陽(yáng)性率基本呈遞增趨勢(shì);p16蛋白的陽(yáng)性率呈遞減趨勢(shì)。

表1 Bmi-1、p16在宮頸各組病變中的蛋白表達(dá)

2.2 Bmi-1及p16蛋白與宮頸癌臨床指標(biāo)的關(guān)系 結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 Bmi-1與p16在32例宮頸癌中的表達(dá)及其與臨床的關(guān)系

2.3 Western blot檢測(cè)Bmi-1、p16蛋白在宮頸癌及癌旁組織的表達(dá) Bmi-1蛋白在宮頸癌癌旁組織中表達(dá)極少，而在宮頸癌組織中表達(dá)明顯。相反p16蛋白在宮頸癌癌旁組織中表達(dá)明顯，而在宮頸癌組織中表達(dá)減少。兩種蛋白含量在宮頸癌與癌旁宮頸組織的差異均具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，見(jiàn)表3。

表3 Bmi-1、p16在 18例宮頸癌及癌旁組織中的平均灰度分析()

表3 Bmi-1、p16在 18例宮頸癌及癌旁組織中的平均灰度分析()

檢測(cè)指標(biāo) 癌組織 癌旁組織 t P Bmi-1 106.50±6.03 98.52±5.73 3.839 0.001 p16 97.96±5.94 104.96±5.50 3.388 0.003

3 討 論

近年來(lái)，子宮頸癌發(fā)病率呈年輕化傾向，35歲以下子宮頸癌的發(fā)病率出現(xiàn)上升趨勢(shì)[10]，且以中晚期患者為多，預(yù)后較差。以往關(guān)于宮頸腫瘤的研究提示，其發(fā)病與多種因素有關(guān)，例如人乳頭狀瘤病毒感染、多產(chǎn)、初產(chǎn)年齡、性行為、經(jīng)濟(jì)狀況、吸煙、長(zhǎng)期使用避孕藥等[11]。但近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)宮頸腫瘤是多基因、多因素協(xié)同作用所導(dǎo)致的。因此致宮頸腫瘤的基因作用是研究熱點(diǎn)。

Bmi-1蛋白屬 Ploycomb組蛋白(ploycomb-group，PcG)家族，是多梳基因家族中的一個(gè)癌基因。Bmi-1基因位于人染色體10p13，DNA 大小為4.9 kb，m RNA 為 3199 bp，含10個(gè)外顯子，326個(gè)氨基酸編碼序列。

p16基因是位于染色體9p21區(qū)的腫瘤抑制基因，是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)直接參與細(xì)胞周期調(diào)控的抑癌基因，其編碼的pl6蛋白依賴激酶K4或K6的抑制因子，直接調(diào)控細(xì)胞周期G～S期，是人類惡性腫瘤最為常見(jiàn)的分子事件。研究表明，p16在對(duì)宮頸良性癌變、CIN或癌的鑒別診斷中優(yōu)于目前所用的其他免疫組化抗體[12]。

本研究中發(fā)現(xiàn)在正常宮頸組織中Bmi-1陽(yáng)性表達(dá)率為0，而p16陽(yáng)性表達(dá)率為100%。在宮頸上皮內(nèi)瘤變組織中Bmi-1陽(yáng)性表達(dá)率逐漸增高，p16陽(yáng)性表達(dá)率逐漸降低。在宮頸癌中Bmi-1陽(yáng)性表達(dá)率明顯增高，pl6陽(yáng)性表達(dá)率明顯降低。另外這兩種基因在CINⅢ級(jí)及原位癌組與宮頸癌組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示兩種基因在早期判斷宮頸腫瘤有一定的作用。為進(jìn)一步探討這兩種基因表達(dá)與宮頸惡性潛能的關(guān)系，本研究分析了兩種蛋白表達(dá)在不同臨床病理指標(biāo)間的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這兩種基因的表達(dá)與腫瘤的臨床分期及組織學(xué)分級(jí)相關(guān)，且組織學(xué)分級(jí)越低，Bmi-1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率越高，而p16陽(yáng)性表達(dá)率卻越低。另外本研究發(fā)現(xiàn)，Bmi-1蛋白在宮頸癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織，而p16在宮頸癌旁組織中的表達(dá)明顯高于癌組織，這也說(shuō)明Bmi-1具有抑制子(repressor)的功能，可以阻斷細(xì)胞周期中的p16基因的位點(diǎn)，促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)化和腫瘤形成。

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多步驟的過(guò)程，往往是在致病因素作用同時(shí)，多種基因同時(shí)或先后協(xié)調(diào)作用的結(jié)果。本研究發(fā)現(xiàn)，Bmi-1、p16基因與人體宮頸腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，Bmi-1和p16均參與子宮頸癌前病變、癌變的發(fā)生和發(fā)展。臨床上多種基因的同時(shí)監(jiān)測(cè)，將有利于監(jiān)控宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后的評(píng)估。

綜上所述，檢測(cè)Bmi-1、p16基因?qū)ε卸▽m頸癌生物學(xué)行為、預(yù)后和指導(dǎo)治療具有重要意義。Bmi-1、p16基因有望成為基因治療的新靶點(diǎn)。

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