張巧琳，徐 新，劉 琪，羅春麗

(重慶醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)系教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 400016)

c-Myc是從雞病毒V-myc癌基因和同源物中分離出來(lái)的原癌基因，在細(xì)胞增殖、凋亡和分化等進(jìn)程中起重要作用。c-Myc因基因擴(kuò)增、染色體易位、突變?cè)诙喾N腫瘤中表達(dá)失控，參與腫瘤進(jìn)程[1]。通過(guò)微陣列和實(shí)時(shí)定量PCR發(fā)現(xiàn)c-Myc在腎癌中因基因擴(kuò)增和染色體易位呈高表達(dá)，其表達(dá)量與患者的預(yù)后相關(guān)[2]。有學(xué)者進(jìn)一步研究證實(shí)，c-Myc通路在腎癌中呈持續(xù)活化狀態(tài)，體外 RNAi技術(shù)沉默c-Myc基因能有效抑制腎癌增殖、凋亡并可調(diào)節(jié)相應(yīng)下游分子[3]，但基因沉默對(duì)于腫瘤細(xì)胞的靶向作用有限。

c-Myc編碼產(chǎn)物為轉(zhuǎn)錄因子，主要與Max蛋白形成二聚體調(diào)節(jié)相應(yīng)下游分子從而調(diào)節(jié)腫瘤進(jìn)程。10058-F4是c-Myc小分子抑制劑，可下調(diào)c-Myc蛋白表達(dá)并特異性阻止c-Myc-Max復(fù)合物形成[4-6]。因此，本次實(shí)驗(yàn)預(yù)用c-Myc-Max二聚體小分子抑制劑10058-F 4研究其對(duì)腎癌786-0細(xì)胞增殖和凋亡的作用，探討其潛在治療作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系和主要試劑 786-0細(xì)胞株由本室保存，anti-c-Myc、anti-Bcl-2、anti-p27、anti-p21 和 anti-β-actin 的一抗及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗鼠 IgG均購(gòu)自 Santa CruZ公司，RPMI1640和小牛血清購(gòu)自Gibco公司，M TT購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，10058-F 4購(gòu)自Sigma公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人腎細(xì)胞癌786-0細(xì)胞用含10%新生牛血清的RPM I1640培養(yǎng)液，置于37℃、含CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，常規(guī)換液傳代。

1.3 M TT檢測(cè) 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的786-0細(xì)胞2～5×104個(gè)/m L 100μL接種于96孔板，待細(xì)胞貼壁后加入圖1A所示濃度的10058-F 4，將其每組細(xì)胞做5個(gè)復(fù)孔，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育，培養(yǎng)不同的時(shí)間點(diǎn)后，每孔加入M TT(5 mg/m L)20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清液，每孔加 150μL DMSO，用酶標(biāo)儀570 nm處測(cè)吸光度值。細(xì)胞增殖活力按公式計(jì)算:細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=[1-(OD實(shí)驗(yàn)-OD調(diào)零)/(OD對(duì)照-OD調(diào)零)]×100%。

1.4 FCM檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的786-0細(xì)胞接種于50 mL培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞貼壁后加入 60、100μM 的10058-F4，加藥后繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24 h，用0.25%胰酶消化，PBS洗 3次，600×g離心5 min，加入70%乙醇固定細(xì)胞，1000×g離心10 min去固定液，加入碘化丙啶染色液[1×PBS，0.1%Trton X-100，碘化丙啶(20μg/m L)，RNase A(100μg/m L)]，室溫染色30 min，上流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期，采用PI/annexin-V染色用于檢測(cè)細(xì)胞凋亡，取1×105個(gè)細(xì)胞加入5μL Annexin V-PE及 10 μL的7-AAD，輕輕混勻，避光保存 20 min，加入 200μL緩沖液，立即用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.5 Western blot法檢測(cè) 細(xì)胞用預(yù)冷的 PBS洗3次，用細(xì)胞刮收集細(xì)胞于離心管中，800×g離心 5 min，轉(zhuǎn)移到EP管中，3000×g離心 5 min，加入 RIPA 裂解液，冰上放 30 min，13000×g離心30 min收集上清液，用考馬斯亮藍(lán)于酶標(biāo)儀上測(cè)濃度，加入蛋白上樣緩沖液100℃變性5 min，每個(gè)上樣孔上相同濃度的蛋白，每孔約 50μg，SDS-PAGE，半干轉(zhuǎn)于 PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉3 h，一抗 4℃過(guò)夜，TBS T洗膜 3次，每次10 min，二抗室溫孵育 1 h，TBST洗膜，3次/10 min，ECL顯色。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用S PSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，結(jié)果以表示，以 P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 10058-F 4抑制腎癌細(xì)胞786-0增殖及c-Myc蛋白表達(dá)MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，加入c-Myc小分子抑制劑10058-F4后，抑制腎癌細(xì)胞786-0增殖，且呈濃度依賴(lài)性(P＜0.05，圖 1A)和時(shí)間依賴(lài)性(P＜0.05，圖 1B)，Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示10058-F 4能明顯抑制c-M yc蛋白水平表達(dá)，并呈濃度依賴(lài)性(P＜0.05)，見(jiàn)圖1C。

圖1 10058-F4對(duì)腎癌786-0細(xì)胞增殖及c-Myc蛋白表達(dá)的影響

圖2 10058-F 4對(duì)腎癌786-0細(xì)胞周期和凋亡的影響

圖3 Western blot法檢測(cè)10058-F4對(duì)腎癌786-0細(xì)胞p21、p27和Bcl-2蛋白表達(dá)

2.2 10058-F 4阻止786-0細(xì)胞周期并誘導(dǎo)凋亡 用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期結(jié)果顯示，60μM 和 100μM 的 10058-F4均可阻止786-0細(xì)胞周期于G0/G1期(P＜0.05)，見(jiàn)圖2A，進(jìn)一步PI/annexin-V雙染流式檢測(cè)顯示，100μM的10058-F4作用786-0細(xì)胞24h可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但作用不明顯，進(jìn)一步檢測(cè)其48 h時(shí)細(xì)胞凋亡，發(fā)現(xiàn)其凋亡細(xì)胞增多，對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為(6.2±0.91)%，60μM 的 10058-F4細(xì)胞凋亡率為(13.07±0.64)%，100μM 的10058-F4細(xì)胞凋亡率為(17.97±0.55)%(P ＜0.05)，見(jiàn)圖2。

2.3 10058-F 4影響p21、p27和 Bcl-2蛋白表達(dá) Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示，10058-F4可上調(diào)p21和p27蛋白表達(dá)，并明顯下調(diào)Bcl-2蛋白，且呈濃度依賴(lài)性(P＜0.05)，見(jiàn)圖3。

3 討 論

c-Myc及其所調(diào)節(jié)的信號(hào)通路在腎癌的發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，抑制 c-Myc表達(dá)能有效抑制腎癌生長(zhǎng)[3，7]。目前主要采用RNAi技術(shù)和寡義核苷酸鏈等抑制c-Myc表達(dá)，但這些技術(shù)對(duì)腫瘤靶向具有局限性。研究發(fā)現(xiàn)，c-Myc主要與Max等形成二聚體調(diào)節(jié)腫瘤惡性生物學(xué)行為，小分子抑制劑10058-F4可特異性抑制c-Myc-Max形成。本次研究采用c-Myc小分子抑制劑10058-F4作用于腎癌786-0細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其能有效抑制腎癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡。

c-M yc蛋白屬于具有DNA結(jié)合域的轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)細(xì)胞周期起正向調(diào)節(jié)作用，c-Myc基因激活導(dǎo)致大量G0期細(xì)胞提前進(jìn)入細(xì)胞周期，推動(dòng)G0/G1期細(xì)胞向S期轉(zhuǎn)變[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，c-Myc小分子抑制劑 10058-F 4，抑制腎癌 786-0細(xì)胞增殖并明顯阻止細(xì)胞周期于G0/G1。p21、p27是細(xì)胞周期素依賴(lài)性激酶抑制蛋白，通過(guò)抑制CDK的激活使細(xì)胞周期阻止于G1期，同時(shí) p21、p27是 c-Myc的靶基因[9]。10058-F4可明顯上調(diào)p21、p27蛋白表達(dá)水平。p21、p27作為c-Myc的靶基因，當(dāng)c-Myc蛋白水平降低和Max形成二聚體減少，對(duì)下游分子的調(diào)節(jié)作用減弱，p21、p27所受抑制作用相應(yīng)減弱，表達(dá)上調(diào)。10058-F4有可能是通過(guò)抑制c-Myc活性及與Max二聚體的形成，間接上調(diào) p21、p27蛋白表達(dá)，從而抑制腎癌細(xì)胞增殖，阻止細(xì)胞周期于G0/G1。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，10058-F 4可誘導(dǎo) 786-0細(xì)胞凋亡并可下凋c-Myc凋亡相關(guān)下游分子Bcl-2蛋白水平，但在24 h時(shí)作用并不明顯，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，誘導(dǎo)凋亡作用增加，呈現(xiàn)時(shí)間依賴(lài)性，這可能是由于細(xì)胞內(nèi)被抑制的目標(biāo)蛋白有一定的半衰期，只有當(dāng)目標(biāo)蛋白降解以后，10058-F4的抑制效應(yīng)才顯現(xiàn)出來(lái)。

c-Myc在多種腫瘤中表達(dá)失控，如參與腫瘤的發(fā)生，其中包括腎癌，下降c-Myc性活能有效阻止腫瘤進(jìn)程。c-Myc有望成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)，c-Myc小分子抑制劑10058-F4特異性下調(diào)c-Myc表達(dá)，抑制c-Myc功能二聚體形成，間接有效調(diào)節(jié)c-Myc靶基因，有望為腎癌治療開(kāi)辟新途徑。

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