畢研文,楊永恒,宮俊華,陳寶芳,劉政波

(泰安市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院,山東泰安271000)

黃精(Polygonatum sibiricumRed.)和多花黃精(Polygonatum cyrtonemaHua.)為百合科黃精屬多年生草本植物,分別習(xí)稱“雞頭黃精”“姜形黃精”,在山東泰山地區(qū)統(tǒng)稱為泰山黃精,是“泰山四大名藥”之一,根莖入藥,具有補(bǔ)腎益精、滋陰潤(rùn)燥等功效[1]。近年來(lái),有關(guān)黃精化學(xué)成分研究報(bào)道日趨增多,至今已確定主要含有多糖、低聚糖、皂苷、氨基酸等活性成分[2-3]。黃精多糖具有抗菌[4]和增強(qiáng)免疫力作用[5]。現(xiàn)代藥理研究表明,薯蕷皂苷口服后經(jīng)腸道菌群代謝產(chǎn)生的薯蕷皂苷元,具有降血脂、抗病毒等作用[6-7],薯蕷皂苷元被認(rèn)為是黃精的主要有效成分[6]。但2005版《中國(guó)藥典》中僅以葡萄糖的含量作為控制黃精藥材質(zhì)量的指標(biāo),專屬性和實(shí)用性不強(qiáng),不能夠較為準(zhǔn)確的控制黃精的質(zhì)量。為此,本實(shí)驗(yàn)采用苯酚-硫酸比色法測(cè)定了黃精和多花黃精中多糖的含量,并應(yīng)用RPHPLC測(cè)定了兩種黃精薯蕷皂苷元的含量。結(jié)果表明該方法簡(jiǎn)便、快捷、可靠,可為黃精和多花黃精的質(zhì)量控制提供依據(jù),也為以后藥典的增訂提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)材料

UV-2450紫外可見(jiàn)分光光度計(jì),日本島津公司。SZ-93自動(dòng)雙重蒸餾水器(上海亞榮生化儀器廠);FW177型中草藥粉碎機(jī)(天津泰斯特儀器有限公司)。高效液相色譜儀(Waters 600E美國(guó),包括600E四元梯度泵,2996二極管陣列紫外檢測(cè)器,中文Empower色譜管理系統(tǒng),四通道脫氣機(jī));SZ-93自動(dòng)雙重蒸餾水器(上海亞榮生化儀器廠);KQ5200D數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。葡萄糖(分析純,天津市四通化工廠),濃硫酸、乙醇及蒽酮均為分析純,水為二次蒸餾水。黃精,多花黃精均采自泰安市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院中草藥圃。對(duì)照品薯蕷皂苷元購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。乙腈(分析純,天津永大試劑廠),水為二次蒸餾水,其他試劑均為分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 多糖的測(cè)定[8-9]

2.1.1 對(duì)照品溶液的配制 精密稱取經(jīng)105℃干燥至恒重的無(wú)水葡萄糖對(duì)照品33 mg,置100 mL量瓶中,加水溶解并稀釋至刻度,搖勻,即得。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密量取對(duì)照品溶液0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6 mL,分別置10 mL具塞試管中,各加水至2.0mL,混勻,在冰水浴中緩緩加0.2%蒽酮-硫酸溶液至刻度,混勻,放冷后置水浴中保溫10 min,取出,立即置冰水浴中冷卻10 min,取出,以相應(yīng)試劑為空白。照紫外-分光光度法,在582 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo),濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程為Y=0.028 4X+0.072 7,r=0.998 6,濃度在3.30～19.80 μ g/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.3 樣品溶液的制備及測(cè)定 分別稱取60℃干燥至恒重的黃精和多花黃精0.25 g,置圓底燒瓶中,加入80%乙醇150 mL,置水浴中回流1 h,趁熱過(guò)濾,殘?jiān)?0%乙醇洗滌3次,每次10 mL,將殘?jiān)盀V紙置燒瓶中,加水150 mL,置沸水浴中加熱回流1 h,趁熱過(guò)濾,殘?jiān)盁坑脽崴礈?次,每次10 mL,合并濾液與洗液,放冷,轉(zhuǎn)移至250 mL量瓶中,加水至刻度,搖勻,精密量取1 mL,置10 mL具塞試管中,照標(biāo)準(zhǔn)曲線得制備項(xiàng)下的方法,自加水至2.0 mL起,依法測(cè)定吸光度,計(jì)算。黃精和多花黃精多糖含量分別為107.52 mg/g和80.41 mg/g。

2.2 薯蕷皂苷元含量的測(cè)定[10]

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Symmetry-C18(4.6 mm×250 mm,5 μ m);流動(dòng)相 CH3CN-H2O(94∶6,V/V);流速1.0 mL/min;測(cè)定溫度為25℃;PDA檢測(cè)器,檢測(cè)波長(zhǎng)為 203 nm;進(jìn)樣 20 μ L 。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 精密稱取薯蕷皂苷元6.87 mg,置10 mL容量瓶中,加甲醇定容,搖勻。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密量取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8 mL分別置于10mL容量瓶中,加甲醇定容,搖勻,分別吸取不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液20 μ L,按2.2.1色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以峰面積為縱坐標(biāo),標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程為Y=158.92X+301.21,r=0.998 3,薯蕷皂苷元在13.74～54.96 μ g/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.4 樣品溶液的制備及測(cè)定

2.2.4.1 未水解樣品的測(cè)定 取黃精、多花黃精粉末各10 g,置圓底燒瓶中加250 mL乙醇,搖勻,稱重,加熱回流4 h,放冷,稱重,用乙醇補(bǔ)足重量,搖勻,過(guò)濾。精密量取濾液100 mL,蒸干,殘?jiān)眉状嫁D(zhuǎn)移到5 mL容量瓶中,定容,搖勻,用高效液相色譜法測(cè)定,結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2.4.2 水解樣品的測(cè)定 另同法取100 mL濾液,蒸干乙醇,殘?jiān)?00 mL、3 mol/L的鹽酸溶解,沸水回流4 h,冷卻,移至分液漏斗中,加氯仿200mL(100,50,50 mL)萃取3次,合并氯仿液,沸水浴蒸干氯仿,殘?jiān)蛹状既芙?定容至25 mL容量瓶中,搖勻,用高效液相色譜法測(cè)定,結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 樣品測(cè)定結(jié)果

2.2.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取薯蕷皂苷元對(duì)照品溶液(20.61 μ g/mL),按上述色譜條件,重復(fù)進(jìn)樣6次,每次20 μ L,測(cè)定薯蕷皂苷元峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.46%,表明儀器精密度良好。

2.2.4 重復(fù)性試驗(yàn) 稱取同一批的黃精樣品5份,按水解樣品溶液制備方法操作,進(jìn)樣20 μ L,測(cè)定薯蕷皂苷元的峰面積的RSD為3.41%。表明分析方法重復(fù)性良好。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份黃精水解樣品溶液,分別在放置 0,2,4,6,8 h 后進(jìn)樣,進(jìn)樣 20 μ L,進(jìn)行穩(wěn)定性考察。結(jié)果表明,在8 h內(nèi)4種薯蕷皂苷元的色譜峰面積沒(méi)有明顯變化,RSD分別為0.78%。表明供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.2.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已測(cè)知含量的黃精藥材粉末6份,分別精密加入等量的對(duì)照品薯蕷皂苷元,按2.2.1和2.2.6項(xiàng)下方法測(cè)定,薯蕷皂苷元的平均回收率為103.48%,RSD為3.11%。

3 結(jié)論

未水解的黃精和多花黃精中均未檢測(cè)到薯蕷皂苷元,可能由于薯蕷皂苷元含量太低有關(guān)。水解后黃精和多花黃精中薯蕷皂苷元的含量分別為0.19 mg/g和0.18 mg/g。黃精和多花黃精藥材分布廣、資源豐富,且在抗癌、降血脂方面具有顯著的療效,因此有必要對(duì)黃精和多花黃精進(jìn)行系統(tǒng)和深入的研究。

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