徐紹成 楊 瑞 楊勁松

乳酸菌是指一群通過發(fā)酵糖類生產(chǎn)大量乳酸的細(xì)菌的總稱，是革蘭氏陽性菌、不形成芽孢(個別屬除外)、不進(jìn)行呼吸的球菌或桿菌，在發(fā)酵碳水化合物時主要的代謝產(chǎn)物為乳酸[1]。乳酸菌是促進(jìn)青貯料發(fā)酵酸化成熟的有益菌群，為降低青貯損失，提高青貯品質(zhì)，許多國家正研究使用乳酸菌添加劑。大量研究結(jié)果表明，乳酸菌具有調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、抑制腸道致病菌定植、提高機體免疫力、改善機體營養(yǎng)狀況等作用，因而在多個領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用[2]。乳酸菌在自然界分布廣泛，人、畜、禽腸道、許多食品、物料及少數(shù)臨床樣品中均有存在。本試驗對自然界中的香蕉莖葉表面附著的乳酸菌進(jìn)行分離,并對分離菌株性能進(jìn)行了初步研究，從中篩選出性狀優(yōu)良的乳酸菌，為制備優(yōu)良的青貯飼料專用發(fā)酵劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

樣品來源：從海南省中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院基地中采集樣品。

培養(yǎng)基：MRS培養(yǎng)基，鑒定用培養(yǎng)基[3]。

主要設(shè)備：超凈工作臺、高壓滅菌鍋、恒溫培養(yǎng)箱、PHS-2C精密酸度計、厭氧裝置、顯微鏡。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品的制備

將采來的香蕉莖葉切碎，用四分法均勻稱取10 g樣品于90 ml無菌生理鹽水中，振蕩均勻，靜置2 h，用移液管吸取1 ml，加入到裝有9 ml無菌生理鹽水的試管中，逐次稀釋至 10-5，選擇 10-3、10-4、10-5三個稀釋度。

1.2.2 菌株的分離

分別取這3種稀釋液0.1 ml，采用涂布法，用含10%CaCO3的MRS固體培養(yǎng)基進(jìn)行分離，經(jīng)37℃恒溫厭氧培養(yǎng)48 h。挑取典型菌落，仔細(xì)觀察菌落形態(tài)，同時進(jìn)行革蘭氏染色、油鏡下觀察菌體形態(tài)和接觸酶試驗。

1.2.3 乳酸菌屬的鑒定試驗

根據(jù) R.E Buchanan（1984）、楊潔冰（1996）[4-5]介紹，凡是革蘭氏陽性，過氧化氫酶試驗陰性，在MRS培養(yǎng)基上菌落周圍形成明顯的透明環(huán)的所有分離菌，均初步定為乳酸菌。在確定為乳酸菌的前提下，進(jìn)一步進(jìn)行明膠液化試驗、吲哚試驗、H2S產(chǎn)生試驗、pH值4.5生長試驗、硝酸鹽還原試驗等來確定屬的劃分。

1.2.4 乳酸菌種的鑒定試驗

根據(jù)凌代之等（1999）[6]介紹，乳酸菌種的鑒定主要是根據(jù)供試菌株對碳水化合物的發(fā)酵產(chǎn)酸試驗，即通過對單糖、二糖、三糖、多糖以及糖苷和糖醇類等碳水化合物的利用情況來區(qū)分。

1.2.5 用于制作青貯飼料發(fā)酵劑的優(yōu)良乳酸菌篩選試驗

將分離并鑒定的3株乳酸菌分別按3%的接種量傳入MRS液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)。每隔2 h測定不同菌株發(fā)酵液pH值，繪制的產(chǎn)酸速率曲線是不同發(fā)酵時間(h)所對應(yīng)發(fā)酵液pH值的變化[7]。根據(jù)不同菌株的產(chǎn)酸能力以及產(chǎn)酸速率來篩選適宜用作青貯飼料的菌株。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落形態(tài)和細(xì)胞形態(tài)檢測結(jié)果

經(jīng)厭氧培養(yǎng)48 h后，觀察菌落的形態(tài)和特征，分別挑取典型菌落且周圍有碳酸鈣透明圈的單菌落共5 株，分別命名為 HN1、HN2、HN3、HN4、HN5，革蘭氏染色、菌落特征及細(xì)胞形態(tài)、大小、排列方式鑒定結(jié)果見表1。

從表1可以看出，從香蕉莖葉中分離的5株菌種中，HN4和HN5為G-，不符合乳酸菌特性。其余3株均為G+，菌落光滑、濕潤，符合乳酸菌特性。對菌體形態(tài)和排列方式的觀察可知，HN1菌株具有植物乳酸桿菌的形態(tài)學(xué)特征，HN2菌株具有短乳桿菌的形態(tài)特征，HN3具有乳酸片球菌的形態(tài)特征。

表1 5株菌的形態(tài)特征

2.2 乳酸菌的鑒定

2.2.1 桿菌HN1、HN2屬種鑒定的結(jié)果

對初步篩選到的兩株桿菌進(jìn)行了進(jìn)一步的試驗鑒定，結(jié)果見表2、表3。

從表2、表3可見，所有菌種都能水解淀粉，KOH試驗、接觸酶試驗、明膠液化試驗、吲哚試驗均為陰性，但對多種糖的利用情況不同。綜合乳酸菌分類鑒定的文獻(xiàn)資料，可將HN1株菌種初步確定為植物乳桿菌，HN2菌株確定為短乳桿菌。

表2 HN1、HN2生化試驗結(jié)果

表3 HN1、HN2碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)酸試驗結(jié)果

2.2.2 球菌HN3屬種鑒定結(jié)果（見表4）

由表4可知，HN3不運動，不產(chǎn)生吲哚，不還原硝酸鹽，發(fā)酵葡萄糖不產(chǎn)氣等，符合片球菌屬的特征。在對各種碳水化合物的發(fā)酵試驗中,HN3能利用木糖、海藻糖和核糖，因此，可初步判定HN3為乳酸片球菌。

表4 HN3菌株生理生化特征及糖發(fā)酵試驗

2.3 產(chǎn)酸速率測定結(jié)果（見圖1）

圖1 不同菌株的產(chǎn)酸速率

如圖1所示，在接入3%的接種量后，3株分別很快進(jìn)入對數(shù)生長期，在前12 h，代謝速度都在加快，產(chǎn)酸量明顯增加，pH值很快下降；在12～18 h的穩(wěn)定期中，菌體產(chǎn)酸量明顯減少，18 h后，產(chǎn)酸量幾乎不再增加，pH值趨于穩(wěn)定。其中植物乳桿菌HN1和短乳桿菌HN2兩株菌株的產(chǎn)酸性能較好，HN1菌株的產(chǎn)酸能力最強，18 h左右pH值就能達(dá)到3.2，而HN2菌株在18 h后也能達(dá)到3.6。球菌HN3的產(chǎn)酸速率比較差。產(chǎn)酸速度是乳酸菌活力良好的重要特征之一，不同菌株間存在較大的差異。在青貯飼料制備過程中pH值的快速并且大幅度的降低能夠顯著抑制青貯玉米原料中的那些對青貯飼料品質(zhì)有不良影響的微生物，如丁酸菌、絲狀真菌、酵母及霉菌的生長，從而提高青貯飼料的品質(zhì)。因此，植物乳桿菌HN1和短乳桿菌HN2可被用來制作優(yōu)良的香蕉青貯發(fā)酵劑。

3 討論及結(jié)語

本試驗從海南熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院采集的香蕉莖葉樣品中分離到3株乳酸菌，首先用傳統(tǒng)的生理生化性質(zhì)測定方法進(jìn)行初步的種屬鑒定，其中一株為植物乳桿菌，一株為短乳桿菌，還有一株為乳酸片球菌。

通過本試驗分離到的3株乳酸菌產(chǎn)酸能力測定結(jié)果表明，HN1和HN2株菌的對數(shù)生長期較長，產(chǎn)酸性能較高，分別達(dá)到了3.2和3.6，而片球菌HN3產(chǎn)酸能力較差，這符合Nancy J.Gardner等（2001）片球菌在產(chǎn)酸能力上確實稍差于乳桿菌的試驗結(jié)果[8]。本試驗所分離菌株具有適應(yīng)期短，對數(shù)生長期長，菌液pH值下降較快，產(chǎn)酸性能較高的特點；同時，具有耐高溫，耐干旱等海南熱帶特色特點，上述特點表明，HN1和HN2菌株適合開發(fā)作為香蕉莖葉青貯飼料微生態(tài)制劑。

[1]朱丹宇,王英,周劍忠,等.酸馬奶中乳酸菌的分離和鑒定[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2009(1):245－246.

[2]劉文華,任慧英,鄒玲,等.一株優(yōu)良乳酸菌的分離鑒定與特性研究[J].中國畜牧獸醫(yī),2008,35(2):153－153.

[3]Jeppesen V F,Huss H H.Characteristics and Antagonistic Activity of Lactic Acid Bacteria Isolated from Chilled Fish Products[J].International Journal of Food Microbiology,1993,18:305－320.

[4]R.E Buchanan.伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(第八版)[M].北京:科學(xué)出版社,1984：702－810.

[5]楊潔冰.乳酸菌生物學(xué)基礎(chǔ)及應(yīng)用[M].北京:中國輕工業(yè)出版社,1996：7－30.

[6]凌代之,東秀珠.乳酸細(xì)菌分類鑒定及實驗方法[M].北京：中國輕工業(yè)出版社，1999.

[7]劉飛,楊麗杰,侯俊財,等.青貯飼料中優(yōu)良乳酸菌的分離鑒定[J].江西飼料,2007(1):22－23.

[8]N J Gardner,T Savarda,P O bem eierb,et al Selection and characterization of mixed starter cultures for lactic acid fem entation of carrot cabbage,beet and onion vegetable mixtures[J].International Joumal of Food Microbiology,2001,64(3):261－275.