關(guān)鳳英,李紅,于秀霞,楊世杰

中藥黃芪為豆科植物膜莢黃芪(Astragalus membranaceus Bge)和蒙古黃芪(Astragalus membranaceus Bge.Var.monhokicus(Bge)Hasiao)的干燥根。其味甘、性溫,有補(bǔ)氣升陽(yáng)、固表止汗、托毒排膿、利水消腫和生肌等功效,為補(bǔ)氣要藥。其作用非常廣泛,對(duì)多種疾病尤其是心血管疾病,如缺血缺氧心肌具有確切的保護(hù)作用。它的藥理作用機(jī)制大多是綜合性的,主要涉及到心肌代謝的改善、自由基的清除、Na+-K+-ATPase活性的抑制等方面,但對(duì)其確切的保護(hù)機(jī)制缺乏深入研究。本實(shí)驗(yàn)在離體細(xì)胞水平就黃芪注射液(Astragalus injection,AI)預(yù)適應(yīng)作用保護(hù)機(jī)制進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料 1 d齡新生清潔級(jí)Wistar大鼠乳鼠:吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。四甲基偶氮唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium,MT T):SIGMA公司;黃芪注射液(每支10 ml,相當(dāng)于原生藥20 g,批號(hào):Z51021776):成都地奧九泓制藥廠;小牛血清:杭州四季青公司;高糖Dulbecco最低必需培養(yǎng)液(IMDM):Hyclone公司;胰酶:DIFICO公司;乳酸脫氫酶(lac-tate dehydrogenase,LDH)及一氧化氮(nitric oxide,NO)檢測(cè)試劑盒:南京建成生物工程研究所。胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)熒光探針DCFH、內(nèi)皮型一氧化氮合成酶抑制劑(NG-nitro-L-arginine methyl ester,L-NAME)、羅 丹 明-123(Rhodamine123,Rh123):SIGMA公司;細(xì)胞凋亡AnnixinV/FITC/PI雙染試劑盒:晶美。酶標(biāo)儀:成都泰盟儀器有限公司;GF-200半自動(dòng)生化測(cè)定儀:山東高密彩虹儀器有限公司;6010-紫外分光光度計(jì):安揭倫上海分析儀器廠生產(chǎn)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 取出生1 d Wistar大鼠乳鼠,在其劍突下剪開十字切口,取下心臟;磷酸緩沖液(PBS)沖洗后,將心肌組織剪碎,經(jīng)0.1%胰酶消化;收集消化后的懸液,加入含10%胎牛血清IMDM,1500 r/min離心10 min,棄去上清,以含10%胎牛血清 IMDM懸浮,接種于10 cm培養(yǎng)瓶中;用差速貼壁法于CO2孵箱中培養(yǎng)90 min。加入成纖維細(xì)胞抑制劑5-溴脫氧脲苷100 μ mol/L,記數(shù)后以2×105/L密度再次接種于孔板或培養(yǎng)瓶中,待心肌細(xì)胞呈半融合狀態(tài)后換為不含血清的IMDM培養(yǎng)液,同步化12 h后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)分為:①對(duì)照組(Control):心肌細(xì)胞不做任何處理;②模型組(Model):加入過氧化氫(hydrogen peroside,H2O2)0.15 mmol/L制備氧化損傷模型;③黃芪注射液高、中、低劑量組(AI,90 g/L、30 g/L和10 g/L):AI+Model;④L-NAME干預(yù)組:AI(90 g/L)+Model+L-NAME(20 μ g/L)。 ③、④組心肌細(xì)胞加入各種藥后孵育30 min,再加入H2O2損傷5 h。

1.3 MT T法測(cè)定細(xì)胞存活力 與實(shí)驗(yàn)孔平行設(shè)不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液的空白對(duì)照孔,比色時(shí)以空白孔調(diào)零。心肌細(xì)胞存活力以酶標(biāo)儀490 nm處(A)值表示。

1.4 培養(yǎng)基中LDH、NO含量測(cè)定 取心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清200 μL,檢測(cè)LDH 和NO含量,按照試劑盒說明進(jìn)行操作。

1.5 ROS生成量 加入H2O2后 30 min,每組3復(fù)孔,將處理過的心肌細(xì)胞棄去培養(yǎng)基,用Hepes液洗3次。加入 DCFH 10 μ mol/L負(fù)載液,避光孵育 30 min,棄去負(fù)載液;Hepes液洗3次后,重新添加Hepes液200 μL。將負(fù)載好的細(xì)胞放在激光共聚焦顯微鏡下,設(shè)定參數(shù),在波長(zhǎng)485 nm處激發(fā),發(fā)射波長(zhǎng)530 nm,掃描細(xì)胞(1次/s),記錄 ROS熒光強(qiáng)度。

1.6 心肌細(xì)胞線粒體膜電位(ΔΨ m) 心肌細(xì)胞以2×105/L密度接種于24孔板,同上實(shí)驗(yàn)分為4組,每組3復(fù)孔。將處理過的心肌細(xì)胞棄去培養(yǎng)基,加入0.25%胰酶消化后收集到1.5 ml的Effindoff管中,用PBS洗3次。加入5 mg/L Rh123負(fù)載液50 μL,避光孵育10 min,棄去負(fù)載液,PBS洗3次,用EILITE型流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度變化。

1.7 細(xì)胞凋亡率 分組同前。原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞以1×106/L接種于100 ml培養(yǎng)瓶,0.25%胰蛋白酶消化,PBS 洗滌 2次,加入200 μL結(jié)合緩沖液懸起,取 100 μL細(xì)胞懸液于5 ml流式管中,加入5 μL annixinV/FITC和 20 μ g/ml碘化丙啶(propidium iodide,PI)10 μL,混勻后室溫避光孵育 15 min,在反應(yīng)管中加PBS 400 μL,以正常對(duì)照組設(shè)定檢測(cè)參數(shù),用EILITE型流式細(xì)胞儀檢測(cè),光源為488 nm氬離子激光器,FITC受激發(fā)后發(fā)綠色熒光,PI發(fā)紅色熒光。每個(gè)樣本至少收集10000個(gè)細(xì)胞,流式細(xì)胞儀分析,獲得四個(gè)象限組成的細(xì)胞直方圖,每個(gè)象限的細(xì)胞數(shù)就是檢測(cè)細(xì)胞總數(shù)所在點(diǎn)的組分。左下象限代表正常細(xì)胞(An-PI-),右下象限代表早期凋亡細(xì)胞(An+PI-),右上象限代表晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞(An+PI+),左上象限代表細(xì)胞收集過程中出現(xiàn)的損傷細(xì)胞(An-PI+)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù),數(shù)據(jù)以(±s)表示,組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 心肌細(xì)胞存活力 模型組心肌細(xì)胞存活力較對(duì)照組明顯下降(P＜0.01),各劑量AI組心肌細(xì)胞存活力較模型組顯著增高(P＜0.05),其中高劑量組效果最好,見表1。故以下實(shí)驗(yàn)均只選用高劑量組數(shù)據(jù)。

表1 乳鼠心肌細(xì)胞生存能力比較(n=6)

2.2 L-NAME對(duì)黃芪注射液保護(hù)作用的干預(yù) 模型組心肌細(xì)胞存活力較對(duì)照組明顯下降(P＜0.01),培養(yǎng)上清中LDH活性增高(P＜0.05),NO含量略有升高,但無(wú)顯著性差異,ROS明顯升高(P＜0.01),ΔΨ m明顯下降(P＜0.01),細(xì)胞凋亡率明顯上升(P＜0.01);AI組心肌細(xì)胞存活力較模型組明顯增高(P＜0.01),LDH活性明顯降低(P＜0.01),NO活性明顯增高(P＜0.01),ROS明顯降低(P＜0.01),ΔΨ m 明顯上升(P＜0.01),細(xì)胞凋亡率明顯下降(P＜0.01);L-NAME組心肌細(xì)胞存活力較AI組下降(P＜0.05),LDH活性明顯增高(P＜0.01),NO含量下降(P＜0.05),ROS降低幅度減弱(P＜0.05),ΔΨ m下降(P＜0.05),細(xì)胞凋亡率上升(P＜0.05)。見表2。

表2 各組乳鼠心肌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)指標(biāo)比較(n=6)

3 討論

心肌細(xì)胞受外來(lái)因素的影響會(huì)發(fā)生氧化狀態(tài)的改變,即胞內(nèi)ROS升高。ROS是生物體有氧代謝產(chǎn)生的一類活性含氧化合物的總稱,包括超氧陰離子、羥自由基與高活性的單線態(tài)氧、過氧化氫等。過量的ROS可引起細(xì)胞大分子的氧化損傷。H2O2是體內(nèi)氧化代謝的中間產(chǎn)物之一,也是ROS的重要組成部分,大量積聚時(shí)會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用,濃度在0.1～1.0 mmol/L范圍內(nèi),細(xì)胞毒性呈劑量依賴關(guān)系[1]。本實(shí)驗(yàn)采用H2O2損傷心肌細(xì)胞來(lái)模擬體內(nèi)氧化應(yīng)激這一許多心血管疾病共同的病理生理過程,具有細(xì)胞損傷形態(tài)學(xué)明顯,損傷可被藥物對(duì)抗,模型穩(wěn)定的特點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,采用0.15 mmol/L制備的損傷模型無(wú)論從心肌細(xì)胞存活力、LDH漏出量還是細(xì)胞凋亡率方面都顯示出心肌氧化應(yīng)激損傷的模型成立。

本實(shí)驗(yàn)首先考察了不同濃度AI對(duì)H2O2損傷心肌細(xì)胞的保護(hù)作用,結(jié)果顯示各濃度AI對(duì)受損心肌細(xì)胞均具有保護(hù)作用,其中高劑量組(90 g/L)效果最好。故隨后的機(jī)制研究實(shí)驗(yàn)均選用高劑量組。本實(shí)驗(yàn)研究證實(shí),與模型組比較,AI預(yù)處理則可以誘導(dǎo)NO的生成,ROS顯著降低、線粒體膜電位升高及細(xì)胞凋亡率下降,說明AI預(yù)處理后可減少活性氧的生成,降低細(xì)胞受損程度。

NO可由多種細(xì)胞產(chǎn)生,具有廣泛的生理功能。NO和H2O2都是可跨膜的物質(zhì),在許多情況下,NO和H2O2信號(hào)之間相互聯(lián)系。植物學(xué)研究顯示,NO是ROS的清除劑,NO可通過影響過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和抗壞血酸過氧化物酶(ASAPOD)的活性調(diào)節(jié)內(nèi)源性H2O2含量。NO能夠顯著誘導(dǎo)鹽脅迫下小麥葉 SOD和 CAT活力的上升,延緩O2-和H2O2積累,同時(shí)促進(jìn)抗氧化物質(zhì)脯氨酸的含量上升,從而減輕鹽脅迫下小麥葉片的氧化損傷[2]。已有大量研究證明,NO與缺血預(yù)適應(yīng)作用有關(guān)[3-4]。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),AI能夠誘導(dǎo)NO生成,從而推測(cè)AI可能通過NO的生成產(chǎn)生保護(hù)作用。

NO由一氧化氮合酶(oxide synthase,NOS)催化左旋精氨酸生成。迄今為止,已知至少有3種NOS參與NO的生物合成:內(nèi)皮型(eNOS)、誘導(dǎo)型(iNOS)和神經(jīng)元型(nNOS)。eNOS位于內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞膜上,也存在于心肌細(xì)胞上[5-6],基礎(chǔ)活性較低;某些生理活性物質(zhì)與內(nèi)皮細(xì)胞膜上的相應(yīng)受體結(jié)合后,動(dòng)員細(xì)胞Ca2+,引起eNOS活化,觸發(fā)一系列生物事件,如mitoKATP通道開放等[7-8],發(fā)揮保護(hù)作用。當(dāng)AI與eNOS抑制劑 L-NAME共孵育后我們發(fā)現(xiàn),L-NAME降低了AI對(duì)受損心肌細(xì)胞的保護(hù)程度。NOS是NO合成的限速酶,由于NOS活力水平的下降引起NO合成減少,綜合分析可推測(cè)AI的心肌細(xì)胞保護(hù)作用可能與促進(jìn)eNOS生成NO有關(guān)。NO是預(yù)適應(yīng)保護(hù)作用中最重要的觸發(fā)因子,故而其誘導(dǎo)的保護(hù)作用可啟動(dòng)一系列信號(hào)的傳導(dǎo),最終誘導(dǎo)保護(hù)性蛋白,從而抑制心肌細(xì)胞凋亡,穩(wěn)定線粒體膜電位,發(fā)揮保護(hù)作用。其具體下游事件的發(fā)生尚有待系統(tǒng)研究。

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