王國(guó)棟,張冬,郭英華,董果雄

動(dòng)脈粥樣硬化所致心腦血管疾病是當(dāng)前主要死因之一。血管細(xì)胞凋亡可減少細(xì)胞成分在血管內(nèi)膜積蓄、清除炎癥細(xì)胞及減少泡沫細(xì)胞形成。全反式維甲酸(all-transretinoicacid,ATRA)作為一種維生素A類衍生物,可抑制血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)增殖[1],從而減輕動(dòng)脈狹窄。本實(shí)驗(yàn)研究AT RA對(duì)兔頸動(dòng)脈動(dòng)粥樣硬化斑塊是否有抑制作用及其是否促細(xì)胞主動(dòng)凋亡。

1 材料和方法

1.1 材料 試劑與儀器:AT RA:上海第六制藥廠,生產(chǎn)批號(hào):030401;膽固醇:上海生物制劑公司;TUNEL凋亡試劑盒、p53一抗及通用型二抗三抗:中山生物技術(shù)有限公司;VIDAS計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng):德國(guó)歐波同公司。

分組:新西蘭大白兔40只,體重(2.50±0.25)kg,雌雄不限(購(gòu)于山東藥檢所,許可證號(hào):魯動(dòng)質(zhì)字2002012),隨機(jī)分為4組:正常組(n=4)、假手術(shù)組(n=12)、手術(shù)組(n=12)、治療組(n=12)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型的建立及用藥 除正常組外,各組動(dòng)物均給予6%豬油、1.5%膽固醇及92.5%基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)。2周后按Fishman方法[2]施行頸動(dòng)脈內(nèi)膜空氣干燥術(shù):兔靜脈麻醉后,分離右頸總動(dòng)脈(長(zhǎng)約2.5 cm),兩端動(dòng)脈夾臨時(shí)阻斷血流。用流量為250 ml/min的氣流灌注,歷時(shí)8 min造成內(nèi)皮干燥,然后恢復(fù)血流,止血、縫合。術(shù)后肌注青霉素4×105U/d。假手術(shù)組只切開,不進(jìn)行空氣干燥;術(shù)前1 d,治療組給予ATRA 20 mg灌胃,手術(shù)組給予等量植物油灌胃。術(shù)后第2、4周處死動(dòng)物,取目的血管待檢。

1.2.2 取材、病理染色 取右側(cè)頸總動(dòng)脈進(jìn)行HE染色。顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察,并行計(jì)算機(jī)圖像分析,計(jì)算內(nèi)膜、中膜面積及內(nèi)膜與中膜面積比例(I/M)。

1.2.3 凋亡細(xì)胞及p53檢測(cè) TUNEL法細(xì)胞凋亡測(cè)定按照凋亡試劑盒說明操作,TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞為棕黃色核染,TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占全部細(xì)胞數(shù)的比例為細(xì)胞凋亡率。p53一抗稀釋濃度為1∶200,其余操作按照免疫組化步驟進(jìn)行。p53陽(yáng)性細(xì)胞核顯示棕黃色顆粒。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用(±s)表示,采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

手術(shù)過程中,實(shí)驗(yàn)兔因空氣栓塞死亡1只。高脂飲食兔血清中膽固醇和甘油三酯的平均水平為(48.45±10.36)mmol/L和(11.94±3.71)mmol/L,顯著高于正常組(12.27±2.14)mmol/L和(0.76±0.19)mmol/L(P＜0.001)。

2.1 HE染色 正常組和假手術(shù)組兔頸動(dòng)脈內(nèi)膜無明顯細(xì)胞增殖,只有單層內(nèi)皮細(xì)胞覆蓋。術(shù)后2周,手術(shù)組和治療組均有平滑肌細(xì)胞增生,內(nèi)膜增厚。4周時(shí)手術(shù)組內(nèi)膜增生更加明顯,可見內(nèi)皮下泡沫細(xì)胞,出現(xiàn)粥樣硬化斑塊、管腔狹窄;而治療組內(nèi)膜增生不明顯,管腔無明顯狹窄;治療組和手術(shù)組內(nèi)膜(I)、中膜(M)面積及I/M比見表1。

2.2 細(xì)胞凋亡 正常組和假手術(shù)組血管TUNEL染

色僅偶見陽(yáng)性細(xì)胞著色。術(shù)后第2周,手術(shù)組和治療組血管內(nèi)膜下可見部分胞核呈棕黃色陽(yáng)性著色,細(xì)胞凋亡率均明顯高于假手術(shù)組(P＜0.01);血管中層可見少量TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞。第4周,手術(shù)組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞比例較第2周時(shí)減少,而治療組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)仍表達(dá)較多,細(xì)胞凋亡率明顯高于手術(shù)組(P＜0.01)。見表2。

2.3 p53表達(dá) 正常組和假手術(shù)組偶見陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá);第2周和第4周時(shí),治療組和手術(shù)組p53陽(yáng)性細(xì)胞比例均明顯高于假手術(shù)組(P＜0.01);第2周時(shí),治療組陽(yáng)性細(xì)胞比例同手術(shù)組類似(P＞0.05),第4周時(shí)明顯高于手術(shù)組(P＜0.01)。見表2。

表1 兔頸動(dòng)脈內(nèi)膜、中膜面積測(cè)定(mm2)

表2 TUNEL、p53免疫組化陽(yáng)性率(%)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)中,高脂飲食兔的頸總動(dòng)脈在空氣干燥術(shù)后4周,可見內(nèi)膜下增厚、管腔狹窄,說明動(dòng)脈粥樣硬化模型制作成功[3]。

有研究證明,血管損傷后2周內(nèi),平滑肌細(xì)胞的增生和凋亡處于相對(duì)平衡狀態(tài)[4];2周后細(xì)胞凋亡基本停止,而增生繼續(xù),造成內(nèi)膜增厚,管腔狹窄。AT RA治療組細(xì)胞在4周仍有凋亡發(fā)生,使血管損傷后平滑肌細(xì)胞的增殖和凋亡處于一種相對(duì)平衡狀態(tài),從而抑制狹窄。ATRA作為一種具有廣泛生物學(xué)效應(yīng)的維生素A類衍生物,可明顯抑制細(xì)胞增殖[5]。

細(xì)胞凋亡在動(dòng)脈粥樣硬化早期可減少細(xì)胞成分在內(nèi)膜積蓄而防止內(nèi)膜增厚,進(jìn)展期則能清除斑塊的炎癥細(xì)胞并減少泡沫細(xì)胞形成,促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的消退。p53是一種腫瘤抑制蛋白,具有促凋亡的作用,但在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用一直有爭(zhēng)論。有研究發(fā)現(xiàn),血漿p53水平和頸動(dòng)脈內(nèi)膜厚度有關(guān),冠心病患者冠脈粥樣硬化斑塊細(xì)胞中有p53的過度表達(dá)[6-7]。Sanz-González等發(fā)現(xiàn),提高p53功能對(duì)機(jī)械損傷的內(nèi)膜增生有抑制作用[8]。但p53誘導(dǎo)凋亡過程也可能帶來纖維細(xì)胞減少,甚至促進(jìn)斑塊破裂[9]。單純高脂飲食兔頸動(dòng)脈內(nèi)膜下基本沒有p53陽(yáng)性表達(dá),而在空氣損傷后的內(nèi)膜下則出現(xiàn)了較高的陽(yáng)性表達(dá),說明單純高脂血癥引起的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)細(xì)胞凋亡并不明顯,而在內(nèi)膜損傷后的斑塊中細(xì)胞凋亡明顯。實(shí)驗(yàn)中,治

療組在第4周仍然有較高水平的p53表達(dá),考慮ATRA誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可能是通過激活p53而實(shí)現(xiàn)的。針對(duì)血管損傷后細(xì)胞增殖過程中凋亡不足的干預(yù)治療,有望成為治療動(dòng)脈粥樣硬化及再狹窄的方法。但是血管細(xì)胞過度凋亡是否會(huì)引起斑塊纖維帽變薄破裂,尚待進(jìn)一步研究。

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