俞建,胡文志,季玲,孫烈

近年的研究表明,動脈粥樣硬化是一種慢性炎癥性疾病[1]。巨噬細胞參與動脈粥樣硬化(AS)的形成、發(fā)展的全過程,而其表達的誘導型一氧化氮合酶(iNOS)與之密切相關[2]。研究發(fā)現(xiàn),黃酮類藥物具有抗炎抗氧化應激的作用[3],葛根素(Puerarin,Pue)是目前臨床應用較多的黃酮類藥物,對其抗炎作用機制的相關研究較少[4]。本研究通過體外細胞培養(yǎng),應用葛根素作用巨噬細胞,觀察葛根素對內(nèi)毒素誘導巨噬細胞表達iNOS的影響。

1 材料和方法

1.1 主要試劑 RPMI 1640培養(yǎng)粉、TRIzol試劑盒:GIBCO公司;葛根素:SIGMA公司;各種半定量逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈式反應(RT-PCR)試劑和DNA marker:Takara生物公司,引物由上海博新生物公司合成?？筰NOS抗體、HRP標記的羊抗兔IgG抗體:Santa Cruz公司。

1.2 主要儀器 BCM-1000型超凈工作臺:中國蘇州;BB16型CO2培養(yǎng)箱:Heracus公司;CK40倒置相差顯微鏡:Olympus公司;GL-20B型低溫離心機:上海安亭科學儀器廠;PC2400擴增儀:Perkin Elmer公司;各種電泳儀、UVP凝膠圖像掃描系統(tǒng)等。

1.3 細胞培養(yǎng) 小鼠巨噬細胞株RAW264.7,購自中國科學院上海細胞研究所。用RPMI 1640完全培養(yǎng)液(10%胎牛血清,100 U/ml青霉素及 100 μ g/ml鏈霉素)在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)3代,取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.4 iNOS蛋白的測定 取對數(shù)生長期細胞,調(diào)整細胞密度為5×106/ml,接種于6孔板,2 ml/孔。18～20 h換含0.5%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)20～24 h使細胞同步化后,預先2 h加入10、20、40 μ mol/L 葛根素,再用1 μ g/ml LPS刺激細胞18 h。用冰冷的PBS洗滌細胞2次,棄上清液。采用非變性裂解緩沖液提取細胞總蛋白,測定蛋白濃度后,分裝于-80 ℃保存待用。取蛋白樣品40 μ g,加入5×SDS蛋白上樣緩沖液,煮沸5 min后,以10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離;分離的蛋白用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移到PVDF膜,含5%脫脂奶粉 TBST 4℃封閉過夜;加入 1∶1000稀釋的一抗(兔抗iNOS),室溫震蕩孵育 2 h,TBST洗滌3次,每次10 min,加入相應二抗(HRP標記的羊抗兔 IgG,1∶10000),室溫震蕩孵育 1 h,TBST洗滌4次,每次10 min?；瘜W發(fā)光法顯色拍照。以β-tubulin作為內(nèi)參。

1.5 iNOS mRNA的測定 預先2 h加入同上濃度的葛根素,1 μ g/ml LPS刺激7 h。用冰冷的PBS洗滌細胞2次,棄上清液。按TRIzol試劑說明進行細胞總mRNA提取。細胞總mRNA溶于無Rnase水中,采用紫外分光光度計測定其濃度。引物序列為:上游引物 :5′-CCC TTC CGA AGT TTC TGG CAG C-3′,下游引物:5′-GGC TGT CAG AGC CTC GTG GCT T-3′;GAPDH 作為內(nèi)參 ,上游引物 :5′-TGA AGG TCG GTG TGA ACG GAT TTG GC-3′,下 游引物:5′-CAT GTA GGC CAT GAG GTC CAC CA C-3′。根據(jù)一步法RT-PCR試劑盒提供的說明書進行RT-PCR反應。RT-PCR反應產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳,溴化乙錠染色。電泳條帶用數(shù)字成像系統(tǒng)進行分析和拍照。以GAPDH光密度值進行標準校正,計算iNOS產(chǎn)物的相對量。

1.6 統(tǒng)計學方法 所有實驗結(jié)果重復3次,取平均值。計量資料結(jié)果用(±s)表示,多組間差異比較用單因素方差分析,顯著性水平α=0.01。

2 結(jié)果

2.1 iNOS蛋白質(zhì)表達 隨著葛根素濃度的增加,iNOS蛋白質(zhì)表達逐漸減少。見圖1。

圖 1 各組 RAW264.7細胞 iNOS蛋白質(zhì)表達

2.2 iNOS mRNA表達 隨著葛根素的濃度的增加,iNOS mRNA表達逐漸減少。見圖2。

圖2 各組RAW264.7細胞 iNOS mRNA表達

3 討論

一氧化氮(NO)是由NOS催化左旋精氨酸(LArg)生成瓜氨酸的同時釋放出來的。NOS主要有兩種類型:結(jié)構(gòu)型(cNOS)和誘導型(iNOS)。iNOS主要存在于巨噬細胞內(nèi),當內(nèi)皮細胞受損時也可分泌?，F(xiàn)有研究資料顯示,在人和動物的AS斑塊中,iNOS主要在巨噬細胞和平滑肌細胞中表達,iNOS產(chǎn)生的大量一氧化氮與過氧化物結(jié)合生成氧化性很強的過氧亞硝酸鹽化合物,后者能使低密度脂蛋白發(fā)生氧化,或其產(chǎn)生的活性自由基產(chǎn)物引起酪氨酸硝基化或其他修飾,阻斷磷酸化和脫磷酸化,干擾細胞正常的信號通路[5]。還有研究顯示,iNOS在AS斑塊深部表達,是血管壁損害及細胞變性、壞死的誘因之一[6-7]。

實驗研究表明,黃酮類化合物能有效抑制巨噬細胞中iNOS的表達[8]。葛根素是野生植物葛根中異黃酮的主要有效成分之一,其化學名為4'7-二羥基-8-D-葡萄糖基異黃酮,一些基礎研究表明,葛根素具有多種生理和藥理活性,例如降低膽固醇[9]、抗氧化應激[10]、抗腫瘤[11]、改善胰島素抵抗等[11]。其能否調(diào)節(jié)巨噬細胞表達iNOS無相關研究和報道。

我們發(fā)現(xiàn),葛根素對 LPS誘導巨噬細胞 iNOS mRNA及其蛋白質(zhì)表達抑制作用呈濃度依賴性,隨著葛根素濃度的增加,iNOS mRNA及其蛋白質(zhì)表達逐漸減少,基因表達和蛋白質(zhì)表達相一致。因此我們推測,葛根素能作用于巨噬細胞,通過下調(diào)iNOS mRNA的表達,減少巨噬細胞表達iNOS蛋白質(zhì),從而達到抗炎、抗動脈粥樣硬化的作用。

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