戴 璐，李峻志，李安利，祁 鵬，丁仕剛

（1.陜西省微生物研究所，陜西 西安 710043；2.寧陜縣科技局，陜西 寧陜 711600）

羊肚菌是世界最稀有的野生食用菌之一，不僅味道獨(dú)一無二，且營養(yǎng)價(jià)值很高，有 “食用菌皇后”美譽(yù)[1－3]。秦嶺因其得天獨(dú)厚的生態(tài)環(huán)境成為野生羊肚菌的重要產(chǎn)區(qū)。本研究以采自秦嶺中段寧陜縣冷水溝的10株羊肚菌為研究對(duì)象，對(duì)其進(jìn)行了分離、純化和ITS區(qū)序列分析，從分子水平對(duì)樣品進(jìn)行了鑒定。

1 材料與方法

1.1 菌株

羊肚菌樣品 QM－1、 QM－2、 QM－4、 QM－5、 QM－6、QM－7、 QM－12、 QM－14、 QM－15和 QM－16， 采自秦嶺中段寧陜縣冷水溝，海拔997 m～1200 m。10個(gè)樣品的子實(shí)體形態(tài)見圖1。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 孢子彈射法分離菌絲體

將采集到的子實(shí)體清理干凈，無菌操作切下約1 cm2菌蓋，并用凡士林粘于PDA平板的皿蓋中央，25℃恒溫倒置培養(yǎng)1 d～2 d。待彈射至培養(yǎng)基上的孢子萌發(fā)長出菌絲時(shí)，用接種鏟取至PDA平板上繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)接菌絲到新的PDA板，直至沒有雜菌污染。鏟取約0.5 cm2×0.5 cm2大小的菌絲塊，置于鋪有滅菌玻璃紙的PDA平板中央，25℃培養(yǎng)7 d至菌絲長滿平板。

圖1 秦嶺冷水溝采集的10株秦嶺羊肚菌子實(shí)體

1.2.2 菌絲體基因組DNA的提取和ITS區(qū)序列的擴(kuò)增

收集菌絲，用新型植物基因組DNA提取試劑盒（TIANGEN）提取樣品基因組DNA，并保存于4℃。PCR擴(kuò)增 ITS區(qū)， 引物為 ITS1：5’－TCCGTAGGTGAACCT GCGG－3’和 ITS4： 5’－TCCTCCGCTTATTGATATGC－3’[4]，由北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。50μL反應(yīng)體系：引物各 2μL、 模板 2μL、 2×PCRmix （潤德生物技術(shù)有限公司）25μL、 ddH2O 19μL。 反應(yīng)條件： 94℃ 2 min； 94℃1 min， 55℃1 min， 72℃2 min， 30個(gè)循環(huán)； 72℃10 min。用1%的1×TAE瓊脂糖凝膠以DL2000為marker，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳 （60 V，40 min）檢測。

1.2.3 ITS區(qū)序列分析和系統(tǒng)樹構(gòu)建

以PCR產(chǎn)物直接測序，由北京六合華大基因科技股份有限公司完成。用DNAman對(duì)序列進(jìn)行拼接，并對(duì)兩端進(jìn)行修剪。將序列在GenBank上進(jìn)行BLAST分析，利用軟件Clustal X進(jìn)行同源性比較，MEGA4.1繪制分子系統(tǒng)樹。

2 結(jié)果與討論

2.1 ITS區(qū)PCR擴(kuò)增結(jié)果

ITS區(qū)PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖2。

圖2 ITS區(qū)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖 （M:DL2000)

由圖2可見， PCR擴(kuò)增出的目的片段條帶單一清晰，大小在1000 bp和2000 bp之間。序列經(jīng)DNAman拼接后，大小均為1200 bp左右。QM-1為1247 bp，QM-2為1125 bp，QM-4為1182 bp，QM-5為1134 bp，QM-6為1160 bp， QM-7為1180 bp， QM-12為1193 bp，QM-14為1189 bp，QM-15為1145 bp，QM-16為1215 bp。

2.2 BLAST比對(duì)分析結(jié)果

在GenBank數(shù)據(jù)庫中，將所得序列進(jìn)行BLAST分析，發(fā)現(xiàn)10株羊肚菌ITS區(qū)序列都與粗腿羊肚菌 （Morchella crassipes，又名皺柄羊肚菌）的ITS區(qū)序列相似性最大，達(dá)到 97%～98%。QM-1、QM-16與登錄號(hào)為 AJ539482.1的粗腿羊肚菌的ITS序列，QM-2與FJ860052.1，QM-4、QM-12、 QM-14 與 AJ623265.1， QM-5、 QM-6、 QM-7、QM-15與EU701002.1的序列相似性最大，即BLAST結(jié)果表明10株樣品都為粗腿羊肚菌。

2.3 基于ITS區(qū)序列的系統(tǒng)樹

把10個(gè)樣品的ITS序列與GenBank中的黑脈 （小頂）羊肚菌 （Morchella angusticeps Peck）、 尖頂羊肚菌 （M.conica Fr.）、 紅褐羊肚菌 （M.rufobrunnea）、 高羊肚菌 （M.elata Fr.）、肋脈羊肚菌 （M.costata）的ITS序列進(jìn)行比對(duì)，并用MP法構(gòu)建分子系統(tǒng)樹，見圖3。

圖3 基于ITS序列的分子系統(tǒng)樹 （MP法，Bootstrap驗(yàn)證，重復(fù)1000次）

從分子系統(tǒng)樹可以看出，黑脈 （小頂）羊肚菌DQ257338、尖頂羊肚菌GQ304964、高羊肚菌GQ228473、肋脈羊肚菌EF080998、紅褐羊肚菌DQ355921聚為外群，而10株樣品聚為1枝，說明樣品與這幾種羊肚菌有一定的遺傳距離，但樣品彼此之間的遺傳關(guān)系很近。10株樣品內(nèi)又分為3個(gè)小類群，說明即使同為粗腿羊肚菌也可能因?yàn)楹０巍⒅脖坏拳h(huán)境因素的不同導(dǎo)致遺傳變異，ITS序列表現(xiàn)出差異。

3 結(jié)論

以ITS區(qū)作為信號(hào)分子對(duì)秦嶺冷水溝采集的羊肚菌進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)10株樣品都為粗腿羊肚菌 （Morchella crassipes）。rDNA的ITS區(qū)同時(shí)具有多變區(qū)和保守區(qū)，18S、5.8S和28S的序列在進(jìn)化中趨于保守，種間變化小，而內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS1和ITS2作為非編碼區(qū)，最終不加入成熟核糖體，所以受到的選擇壓力較小，進(jìn)化速度快，種間差異大，且變異速度存在著較大的差異，適合種及種以下水平的分類研究[5]。從分子系統(tǒng)樹看來，本研究中的10株粗腿羊肚菌與同屬其他種羊肚菌ITS區(qū)序列具有較大差異，但同時(shí)這10株粗腿羊肚菌也分為3個(gè)小類群，推測可能是因?yàn)楹０?、植被等環(huán)境因素的不同，粗腿羊肚菌與環(huán)境相互作用中協(xié)同進(jìn)化[6]而導(dǎo)致種內(nèi)ITS區(qū)序列的差異，這種種內(nèi)差異還有待將來收集更多的樣品進(jìn)一步深入研究。

[1]謝占玲，謝占青.羊肚菌研究綜述[J].青海大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版， 2007， 25(2)： 36-40.

[2]李華，包海鷹，李玉.羊肚菌研究進(jìn)展[J].菌物研究，2004，2(4)：53-60.

[3]李燁，溫魯.羊肚菌的研究與開發(fā)[J].中國食用菌，2004，23(1)：6-8.

[4]White TJ,Bruns T,Lee S,et al.Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics in PCR protocols:a guide to methods and applications[M].San Diego:CA.Academic Press,1990:315-322.

[5]陳鳳毛.真菌ITS區(qū)序列結(jié)構(gòu)及其應(yīng)用[J].林業(yè)科技開發(fā)，2007，21(2)：5-7.

[6]Bergius N,Danell E.The Swedish matsutake (Tricholoma nauseosum syn.T.matsutake):distribution,abundance,andecology,scandinavian[J].Journal of Forest Research,2000(15):318-325.