許曉燕，鄭林用，李 艷，江 南，余夢瑤，羅 霞**

（1.四川省中醫(yī)藥科學院中藥細胞與分子生物學實驗室，四川 成都 610041；2.四川省農業(yè)科學院，四川 成都 610066；3.成都市經(jīng)濟信息中心，四川 成都 610041）

靈芝（Ganoderma lucidum）是一種廣泛應用的藥、食兼用真菌，具有促進睡眠、緩解機體疲勞、抗腫瘤、調節(jié)免疫、抗HIV等功效[1]。近年來，莊毅等提出用現(xiàn)代生物技術來改造靈芝等藥用真菌，即 “藥用真菌新型固體發(fā)酵工程”，在發(fā)酵基質中增用具有活性成分的各種中藥材作為藥性基質，使發(fā)酵的作用不僅是提供營養(yǎng)成分，而且因真菌的分解和合成作用產(chǎn)生新的成分，使其性質發(fā)生變化，從而使藥用真菌和中藥材原有功效增強，甚至可以產(chǎn)生新的性味、功能，這就具有雙向性，其發(fā)酵產(chǎn)物稱為菌質[2]。

丹參，為唇形科鼠尾草屬丹參 （Salvia miltiorrhiza Bge.）的干燥根及根莖，始載于 《神農本草經(jīng)》，列為上品，具有活血調經(jīng)、祛瘀生新、鎮(zhèn)靜安神、涼血消痛、消腫止痛等功效。在丹參采摘、加工過程中，除去入藥的部分，會產(chǎn)生大量的廢棄?，F(xiàn)代研究表明，邊角料中具有與藥材相似的化學成分，只是含量較低，將其直接廢棄，不僅對環(huán)境造成污染，而且浪費了大量具有潛在價值的資源。

本論文采用新型（雙向性）固體發(fā)酵工程技術，以靈芝為發(fā)酵菌株，在其培養(yǎng)基中增添丹參邊角料，通過培養(yǎng)基優(yōu)化，初步建立靈丹菌質的生產(chǎn)工藝，并檢測靈丹菌質的理化指標（蛋白質、多糖、三萜等），開展其活血化瘀的藥效學研究，旨在為現(xiàn)代菌物藥的研發(fā)提供一種新材料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗菌株

美國大靈芝（Ganoderma sp.），中國農大生物學院食用菌研究室提供。

1.1.2 試驗藥材

丹參邊角料，購自四川省中江縣；丹參藥材，購自四川省成都市中藥材市場。

1.1.3 試驗動物

昆明種小鼠，由四川省中醫(yī)藥科學院實驗動物中心提供（川實質第2002－33號）。

1.1.4 主要試劑

蒽酮（上?；瘜W試劑采購供應五聯(lián)化工廠）；考馬斯亮藍G-250（上海朗瑞精細化學品有限公司）；丹參酮ⅡA、齊墩果酸（中國藥品生物制定鑒定所）。

1.1.5 主要儀器

智能光照培養(yǎng)箱，型號：ZGX-300C，杭州錢龍儀器設備有限公司；紫外分光光度計，型號：T6新世紀，北京普析通用儀器有限責任公司；HPLC系統(tǒng)，型號：Waters 1525，Waters公司；Syncore多樣品定量濃縮儀，瑞士Buchi。

1.2 試驗方法

1.2.1 發(fā)酵樣品制備

靈丹菌質不同發(fā)酵組合培養(yǎng)基配方見表1。

表1 靈丹菌質不同發(fā)酵組合培養(yǎng)基配方比例

按表1配置各組合固體發(fā)酵培養(yǎng)基，控制含水量在60%左右，分裝入袋，115℃滅菌3 h，冷卻后，接入靈芝斜面菌絲（以長度1.0 cm菌絲體為標準），于恒溫 (27±2)℃進行發(fā)酵培養(yǎng)。

1.2.2 菌絲體日平均生長速度觀察

從菌絲體萌發(fā)起，記錄發(fā)酵過程中靈芝菌絲體在各組合培養(yǎng)基質上的平均生長速度。

1.2.3 靈丹菌質多糖、蛋白質和三萜測定

多糖含量測定采用2005版藥典規(guī)定方法[3]硫酸－蒽酮法，蛋白質含量測定采用考馬斯亮藍法，三萜含量測定采用草醛冰醋酸－高氯酸顯色法[4]。

1.2.4 靈丹菌質丹參酮IIA含量的HPLC分析

HPLC條件為檢測流動相：甲醇∶水=75∶25；檢測溫度：30℃； 進樣量為20 μL； 流速：1 mL·min-1； 檢測波長 270 nm。檢測方法為取菌質粉末0.1 g，加入10 mL甲醇，封閉試管口，超聲提取10 min，靜置過夜，HPLC測定。

1.2.5 試藥制備

（1）水提：取定量樣品，加10倍蒸餾水，90℃水浴2.5 h，3000 r·min-1離心30 min，取上清；沉淀再加5倍水、3倍水，同法熱提2次；收集3次熱提所得上清液。

（2）醇提：向水提后的樣品中加入2倍體積的95%乙醇，超聲提取 3 h，3000 r·min-1離心30 min，收集上清液，旋轉蒸發(fā)至結晶。

（3）將步驟（2）所得結晶溶于步驟（1）中所得提取液，揮發(fā)至所需濃度即為藥效學實驗給藥樣品。

1.2.6 對急性腦缺血缺氧小鼠的保護作用

參照 《中藥藥效研究思路與方法》[5]。

1.2.7 對小鼠凝血時間（CT）的影響

參照 《中藥藥效研究思路與方法》[5]。

1.2.8 對小鼠尾出血時間的影響

參照 《中藥藥效研究思路與方法》[5]。

1.2.9 對小鼠尾部血栓形成的影響

參照 《中藥藥效研究思路與方法》[5]。

2 結果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基組合菌絲體生長速度的觀察

從靈芝菌絲體萌發(fā)開始，以2 d～3 d為1個時間單位，記錄菌絲體在固體發(fā)酵培養(yǎng)基上的生長速度，得到靈芝菌絲體生長速度曲線，如圖1所示。

圖1 靈芝在不同組合中的菌絲體生長速度

從圖1可以看出，菌絲生長可分為5個階段：適應生長期，菌絲生長較慢，菌絲較纖弱；旺盛期，菌絲活力較強，代謝旺盛，生長快；下降期，菌絲生長速度急劇下降；回升期，菌絲生長速度有所回升；衰退期，菌絲活力衰退，菌絲老齡化，開始分泌黃褐色素。結果表明，菌絲生長至接種大約15 d后，生長速度趨于平穩(wěn)且緩慢下降，至30 d后，生長速度趨于平緩不變。

2.2 不同靈丹菌質組合的多糖含量

測定發(fā)酵40 d后，菌質的多糖含量，如圖2所示。

從圖2可以看出，發(fā)酵40 d后，菌質組合4的多糖含量最高。

2.3 不同靈丹菌質組合的蛋白含量

發(fā)酵40 d后，測定菌質的蛋白質含量，測定結果如

圖2 各組合靈丹菌質多糖含量變化

圖3所示。

圖3 各組合靈丹菌質蛋白含量變化

從圖3可以看出，發(fā)酵40 d后，菌質組合4的蛋白質含量最高。

2.4 不同靈丹菌質組合的靈芝酸三萜含量

發(fā)酵40 d后，測定菌質的三萜含量，測定結果如圖4所示。

圖4 各組合靈丹菌質三萜含量

隨著丹參邊角料添加比例的逐漸增大，三萜的含量也基本呈現(xiàn)逐漸增大的趨勢，提示靈丹菌質中三萜的含量可能與添加的藥材比例相關。

2.5 不同靈丹菌質丹參酮IIA含量

發(fā)酵40 d后，測定菌質的丹參酮IIA含量，測定結果如表圖5所示。

圖5 各組合靈丹菌質丹參酮IIA含量

從圖5可以看出，組合3和組合4的丹參酮IIA含量最高且相同。

2.6 對急性腦缺血缺氧小鼠的保護作用

從圖2～圖5可以看出，靈丹菌質組合4在40 d中止發(fā)酵后，發(fā)酵產(chǎn)物多糖、蛋白質、三萜和丹參酮IIA含量較高，因此選取組合4的發(fā)酵產(chǎn)物進行活血化瘀的藥效學研究。

2.6.1 對急性不完全腦缺血小鼠的作用

觀察靈丹菌質組合4對小鼠急性腦缺血的保護作用，實驗結果如表2所示。

表2 對急性腦缺血缺氧小鼠的保護作用（x±s，n=10）

相比空白對照組，丹參藥材組、組合4對急性不完全腦缺血小鼠的存活時間均無明顯的延長作用，但是組合4具有一定的作用趨勢。

2.6.2 對斷頭后小鼠喘息時間（急性腦缺氧）的影響

觀察靈丹菌質組合小鼠斷頭后急性腦缺氧的保護作用，實驗結果如表2所示，相比空白對照組，丹參組、組合4對斷頭后急性腦缺氧小鼠的喘氣時間均無延長作用，但對小鼠斷頭造成的急性腦缺氧實驗模型而言，短暫延長斷頭小鼠喘氣時間數(shù)秒，仍可視為對小鼠急性腦缺氧有一定的改善作用，因此，組合4對小鼠急性腦缺氧有一定的改善作用。

2.7 對小鼠凝血時間（CT）的影響

觀察靈丹菌質對小鼠凝血時間的影響。實驗結果如表3所示。

表3 靈丹菌質對小鼠凝血、尾出血時間的影響（x±s，n=10）

相比空白對照組，組合4給藥組的小鼠凝血時間明顯長于空白對照組（p<0.05）。

2.8 對小鼠尾出血時間的影響

觀察靈丹菌質組合4對小鼠尾出血時間的影響。實驗結果如表3所示，相比空白對照組，組合4給藥組的小鼠尾出血時間明顯長于空白對照組（p<0.05）。

2.9 對小鼠尾部血栓形成的影響

觀察靈丹菌質對小鼠尾部血栓形成的影響，實驗結果如表4所示。

注射角叉菜膠24 h后，組合4就表現(xiàn)出明顯的抑制血栓形成作用（p<0.01）；48 h后，丹參藥材組也表現(xiàn)出明顯的抑制血栓形成的作用（p<0.01）；72 h后，2個給藥組均表現(xiàn)出一定的抑制血栓形成的作用。

表4 靈丹菌質組合4對小鼠尾部血栓形成的影響（x±s，n=10）

3 討論

在傳統(tǒng)的固體發(fā)酵中，基質的作用僅是單向性地為真菌生長提供所需碳、氮等營養(yǎng)，以獲得子實體為目的，很少注意發(fā)酵過程中基質本身的變化，以及不同基質對發(fā)酵產(chǎn)物品質的影響。近年來，國內外的研究者已開始研究在培養(yǎng)基中加入藥用植物，進行固體發(fā)酵來提高發(fā)酵產(chǎn)物的品質，如槐芪菌質[6]、韓國藥性米酒[7]。本試驗選用中藥材為靈芝的培養(yǎng)基質之一，不僅觀察了在培養(yǎng)基質中添加不同比例的丹參藥材后，靈芝生長情況及菌質多糖、蛋白質、三萜、丹參酮的變化趨勢，還進行了菌質提取物活血化瘀的藥效學試驗。試驗結果表明，從菌絲體日平均生長曲線圖可以看出，在組合2、組合3、組合4三個培養(yǎng)基中，靈芝的生長速度較快，其中在組合4中，其生長最快（0.62 cm·d-1）。從多糖、蛋白質、三萜、丹參酮的含量來看，40 d后，組合4的多糖、蛋白質、靈芝酸三萜、丹參酮含量較高。綜合前面生長情況和成分分析的結果，選取組合4進行小鼠活血化瘀的藥效學實驗。藥效試驗表明，靈丹菌質在腦缺血、缺氧和活血化瘀方面具有比丹參藥材更好的功效；組合4同時具有延長小鼠凝血時間、尾出血時間和抗血栓的作用，表現(xiàn)出良好的活血化瘀功效。

本研究表明，利用有益菌進行雙向發(fā)酵能夠有效提高中藥基質中的藥用成分，能夠為菌物藥研發(fā)提供一種新材料和新思路，并證實了新型固體發(fā)酵這種思路的合理性。

[1]Russell R，Paterson M.Ganoderma-A therapeutic fungal biofactory[J].Phytochemistry，2006，67(2)： 1985-2001.

[2]莊毅，潘揚，謝小梅.藥用真菌 “雙向發(fā)酵”的起源、發(fā)展及其優(yōu)勢與潛力[J].中國食用菌，2007，26(2)：3-6.

[3]國家藥典編委會.中華人民共和國藥典[S].化學工業(yè)出版社，2005.

[4]鄭林用，黃小琴，曾瑾.不同靈芝菌株多糖、三萜化合物比較分析[J].四川大學學報：自然科學版，2007(5)：1121-1124.

[5]陳奇.中藥藥效研究思路與方法[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2005.

[6]莊毅，池玉梅，陳慎寶.藥用真菌新型固體發(fā)酵工程與槐芪菌質的研制[J].中國藥學雜志，2004，29(3)：175-178.

[7]Kim JH,Lee DH,Lee SH.Effect of Ganoderma lucidum on the quality and functionality of Korean traditional rice wine,Yakju[J].Journal of Bioscience and Bioengineering,2004,97(1):24-28.