金宏,于慧榮,公衍玲

(青島科技大學(xué)化工學(xué)院,山東 青島 266042)

肉桂為樟科植物肉桂(Cinnamomum cassia Presl)的樹皮,氣味芳香。肉桂皮含有1%～4%揮發(fā)油,主要成分是肉桂醛(cinnamaldehyde)。肉桂具有補火助陽,引火歸源,散寒止痛等功效,用于陽痿,宮冷,腰膝冷痛,腎虛作喘等[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明肉桂酸和肉桂醛是肉桂中的兩種活性成分,肉桂醛具有鎮(zhèn)靜,鎮(zhèn)痛及解熱作用;肉桂酸具有抗菌,升高白細(xì)胞,利膽,抗癌作用[2]。作者采用GC-MS法對大量肉桂揮發(fā)油樣品進行分析時,發(fā)現(xiàn)肉桂揮發(fā)油圖譜中各種成分出峰先后及其相對含量極具特征性[3-5],易于辨識。本工作利用GC-MS技術(shù)進一步建立肉桂揮發(fā)油的特征指紋圖譜,作為肉桂藥材的質(zhì)量控制依據(jù)。

1 實驗方法

1.1 試劑

10批次肉桂購于青島同仁堂等藥店,經(jīng)鑒定均為肉桂藥材,乙醚、無水硫酸鈉等均為分析純。

1.2 儀器

SFE-100m L超臨界CO2萃取儀;

HP5890-HP5973GC-MS聯(lián)用儀,色譜柱為SGE-30QC 3/AC 225(0.32 mm ×30 m,0.25μm)彈性石英毛細(xì)管柱。

1.3 實驗方法

1.3.1 對照品的制備

精密稱取肉桂醛標(biāo)準(zhǔn)品5mg,于10m L的容量瓶中,加乙醚溶解、稀釋至刻度,備用。

1.3.2 供試液配制

分別取10個批次肉桂各20g,按照超臨界CO2流體萃取法提取肉桂揮發(fā)油[6]、分離純化、稀釋,在相同的色譜條件下進樣分析。

1.3.3 色譜條件

程序升溫為柱初始溫度60℃,保持10min,以4℃/min升至 220℃,保持 25min;汽化室溫度 250℃;檢測器(FID)溫度 250℃;柱壓 60kPa。

2 結(jié)果與討論

2.1 GC-MS分析條件的考察

供試液配制:精取肉桂揮發(fā)油0.1m L,分別用乙醚稀釋 10、50、100、200 倍,進樣5μL 進行分析,結(jié)果顯示以稀釋100倍所得圖譜的分離效果較為理想。

對照品的制備:精密稱取肉桂醛標(biāo)準(zhǔn)品5mg,于10m L的容量瓶中,加乙醚稀釋至刻度,備用。

升溫程序的考察:取肉桂揮發(fā)油供試液,對升溫程序進行考察。結(jié)果顯示,柱初始溫度為 60℃,保持10min,以4℃/min升至220℃,保持25min時各主要成分色譜峰的分離效果較好。

柱前壓與流速的考察:在3種不同柱前壓40、60、80 kPa的條件下進行考察,結(jié)果顯示柱前壓為60kPa時,各主要成分色譜峰的分離效果較好。

汽化室溫度的考察:在3種不同汽化室溫度230、250、270℃時分別用供試液進樣分析,結(jié)果顯示,6種主要成分在3種不同汽化室溫度時相對含量幾無差別,同時各主要成分色譜峰的分離效果較好,本實驗確定以250℃為宜。

檢測器(FID)溫度的考察:在3種不同檢測器溫度230、250、270℃時分別用供試液進樣分析,結(jié)果顯示,6種主成分在3種不同檢測器溫度時相對含量幾無差別,各主要成分色譜峰的分離效果較好,最后確定以250℃為宜。

2.2 方法學(xué)考察

色譜記錄圖考察:取肉桂揮發(fā)油供試液,在已經(jīng)確定的色譜條件下進樣分析3次,結(jié)果表明,15min開始出峰,75～120min時間段不再出峰,提示75min內(nèi)揮發(fā)油成分出峰完全。因此選用15～75min時間段的記錄圖。

儀器精密度考察:在相同的色譜條件下連續(xù)進樣5次,結(jié)果顯示,各主要色譜峰相對保留時間和相對峰面積的RSD值均小于3%,表明儀器精密度較好。

實驗方法的重復(fù)性考察:取肉桂樣品共5份,按相同的提取方法分別提取、分離純化、稀釋,制備出肉桂揮發(fā)油供試液5份,在相同的色譜條件下進樣分析。結(jié)果顯示,各主要色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值均小于3%,表明實驗重復(fù)性較好。

待測樣品的穩(wěn)定性考察:取肉桂揮發(fā)油供試溶液,分別在0、1 、2 、4、6 、8、12、24 、48h 不同的時間點進樣分析。結(jié)果顯示,各主要色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值均小于3%,表明肉桂揮發(fā)油供試液穩(wěn)定較好。

中藥揮發(fā)油組分較多,幾十以至上百種,而以為數(shù)不多的相對含量較大的主要特征性成分作為評價指標(biāo),考察色譜條件的精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性是實際可行的選擇。

2.3 樣品檢測

指紋圖譜的建立:取肉桂20g采用超臨界CO2流體萃取法進行提取、分離純化、稀釋,再分別對10個批次肉桂揮發(fā)油供試液在相同的色譜條件進樣分析,其共有模式圖譜見圖1。其中有6個峰的峰面積比較大且較穩(wěn)定,可以作為其共有峰。經(jīng)過質(zhì)譜計算機數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索,確定了這6個組分,見表1。

表1 肉桂揮發(fā)油中化學(xué)成分分析及其相對百分含量

本研究結(jié)果與以往報道數(shù)據(jù)[2]基本相符,提示肉桂揮發(fā)油的主要成分穩(wěn)定性強,具備指紋圖譜闡述的可行性。

主成分與圖譜特征分析:由10批次肉桂揮發(fā)油的色譜圖可見,肉桂揮發(fā)油主要含有α-蒎烯(α-Pinene)、肉桂 醛 (Cinnamaldehyde)、α-石 竹 烯 (α-Caryophyllene)、桉油精(Eucalyptol)、α-松油醇(α-Terp ineol)、龍腦(Borneol)。

以上成分平均占有揮發(fā)油總量的90%以上,其出峰先后及其相對含量構(gòu)成了肉桂揮發(fā)油的特征指紋圖譜,見圖1。

圖1 肉桂揮發(fā)油的色譜圖

肉桂揮發(fā)油色譜指紋圖譜的最明顯特點是6個強峰,和其它峰相比,表觀豐度相差不大,故在選取共有峰時,這是一個主要特點。同時還應(yīng)兼顧其它細(xì)小的指紋區(qū)域和考慮圖譜的整體性,因此在建立指紋圖譜時,供試品的濃度要適當(dāng),否則細(xì)小的峰會失去,將失去指紋圖譜的意義。

肉桂揮發(fā)油特征指紋圖譜的相似度計算:采用國家藥品監(jiān)督管理局推薦的“中藥指紋圖譜計算機輔助相似度計算軟件”對測定結(jié)果進行計算,得到10個批次肉桂揮發(fā)性成分的共有指紋圖譜的相似度見表2。

從表2結(jié)果可以看出,10批次肉桂揮發(fā)油樣本的相似度都在0.9～1.0,未發(fā)現(xiàn)離群樣本,符合國家藥品監(jiān)督管理局對中藥指紋圖譜相似度的要求。

表2 10批肉桂揮發(fā)油的相似度

2.4 討論

采用本系統(tǒng)得到的肉桂藥材的GC-MS指紋圖譜分離度較好,其中肉桂揮發(fā)油的主成分α-蒎烯、肉桂醛、α-石竹烯、桉油精、α-松油醇、龍腦均可在圖譜中完全展現(xiàn)出來。經(jīng)對照品指認(rèn),指紋圖譜中的2號峰為肉桂醛。

3 結(jié)論

肉桂揮發(fā)油指紋圖譜分析條件:程序升溫為柱初始溫度60℃,保持10min,以4℃/min升至220℃,保持25min;汽化室溫度250℃;檢測器 (FID)溫度250℃;柱壓60kPa。肉桂揮發(fā)油指紋圖譜的研究,使肉桂揮發(fā)油的研究從單一有效成分或指標(biāo)成分的定性定量分析,轉(zhuǎn)向有效成分群體分析,更加科學(xué)、準(zhǔn)確地反映了肉桂的內(nèi)在品質(zhì),因此,肉桂揮發(fā)油的指紋圖譜的建立,可以作為肉桂藥材鑒別和質(zhì)量控制模式,同時也為肉桂中藥制劑指紋圖譜的制定奠定基礎(chǔ)。

[1]衛(wèi)生部藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[S].北京:人民衛(wèi)生出版社,2005:91.

[2]國家醫(yī)藥管理局中草藥情報中心站.植物藥有效成分手冊[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1985:217-219.

[3]張桂芝,張石楠,孟慶華,等.GC-MS分析肉桂與桂皮揮發(fā)油的化學(xué)成分[J].藥物分析雜志,2009,29(8):1256-1259.

[4]周雨,李向高.西洋參揮發(fā)油成分的GC/MS分析[J].分析化學(xué),1997,25(24):412.

[5]魏剛,方永奇,劉東輝,等.GC-MS建立石菖蒲揮發(fā)油特征指紋圖譜方法學(xué)研究[J].中國中藥雜志,2004,29(8):764.

[6]楊云,張晶,陳玉婷,等.天然藥物化學(xué)成分提取分離手冊[M].北京:中國中醫(yī)藥出版社,2003,531-533.