許 璞

（常熟理工學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，江蘇 常熟 215500）

自1862年Thuret報(bào)道了紫菜屬海藻Porphyra umbilicalis與P.leucosticta精子囊的觀察結(jié)果以來(lái)，對(duì)于紫菜生殖器官形成及其性別的研究基本上為描述性的.紫菜的性別表現(xiàn)依據(jù)分類學(xué)描述可基本分為：雌雄同株型，如條斑紫菜（P.yezoensis）；雌雄異株型，如擬線形紫菜（P.pseudolinearies）和狹葉紫菜（P.angusta）；雌雄同株兼有雌雄異株（或雌雄異株兼有雌雄同株）類型，如華北半葉紫菜（P.katadai var.hemiphylla）和壇紫菜（P.haita?nensis）.作為分類學(xué)的重要依據(jù)，雌雄生殖細(xì)胞在藻體上的分布規(guī)律代表紫菜屬物種的特征.在雌雄同株類型中，有的種類分裂為小區(qū)域間生或混生，而有的種類雌雄細(xì)胞分別位于同株藻體的兩側(cè)或上下兩部分.條斑紫菜精母細(xì)胞分裂成熟后形成條帶狀精子囊器區(qū)域，鑲嵌在果孢子囊群中，成為該物種的鮮明特征.然而同為生殖細(xì)胞小區(qū)域混生的種類，有的物種精子囊器區(qū)域較小，且較分散.而少精紫菜（P.oligospermatangia）成熟藻體的外型更象全雌個(gè)體，雄性細(xì)胞分裂區(qū)域極小，精子囊器區(qū)呈很小的點(diǎn)狀出現(xiàn)于果孢子囊群中.半葉紫菜藻體在尚未成熟的時(shí)期就可區(qū)分出雌雄區(qū)域，兩性區(qū)域之間有明顯的界線，分生于藻體的兩側(cè).雌雄同株的壇紫菜在早期生長(zhǎng)階段難以分辨兩性區(qū)域，當(dāng)藻體成熟時(shí)，果孢子囊群和精子囊器常以直線或曲線區(qū)別，各自分布于藻體的不同區(qū)域.雌雄異株的藻體，生殖細(xì)胞多沿藻體的前端和兩側(cè)邊緣形成.日本學(xué)者對(duì)紫菜生殖細(xì)胞分布類型做了一個(gè)近似的歸納總結(jié)：雌雄異株，即藻體只產(chǎn)生單一性別生殖細(xì)胞而有雌、雄藻株之分；雌雄同株，同一藻體上發(fā)生雌、雄生殖細(xì)胞，但兩性生殖組織區(qū)域分生明顯；雌雄同株，兩性生殖細(xì)胞分裂成小區(qū)域間生或混生在一起；雌雄同株，雄性生殖區(qū)域極小或不明顯［1］.

紫菜的性別發(fā)生有什么規(guī)律，為什么會(huì)出現(xiàn)如此多樣的性別表現(xiàn)類型，它們是性決定還是性分化？隨著紫菜減數(shù)分裂發(fā)生在殼孢子萌發(fā)時(shí)期的新證據(jù)出現(xiàn)［2-4］，遺傳學(xué)研究者認(rèn)為性別遺傳機(jī)制可以闡明這一現(xiàn)象.上世紀(jì)90年代初，加拿大藻類遺傳學(xué)家ven der Meer和他的學(xué)生Mitman，對(duì)一種生長(zhǎng)分布在北美地區(qū)的紫菜P.purpurea開(kāi)展了性別遺傳及其決定機(jī)制的研究，其主要結(jié)果包括：P.purpurea減數(shù)分裂發(fā)生在殼孢子萌發(fā)之時(shí)，被突變色素標(biāo)記的萌發(fā)細(xì)胞發(fā)育歷程表明，P.purpurea藻體形成的兩性生殖細(xì)胞區(qū)域，起源于殼孢子最初的分裂細(xì)胞，一個(gè)細(xì)胞僅對(duì)應(yīng)于一種性別的細(xì)胞組織區(qū)域；P.purpurea藻體兩性生殖區(qū)域分生特征是由減數(shù)分裂第一次分裂后，處于頂端位置細(xì)胞第二次分裂所作橫向分裂所致，即這一雌雄同株型藻體的性別表現(xiàn)出分界明晰的左右性，是由早期細(xì)胞分裂生長(zhǎng)模式所決定；對(duì)野外生長(zhǎng)和實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)的藻體所作的性別比例分析，其結(jié)果符合1∶1分離規(guī)律［5］.這一研究結(jié)果說(shuō)明，P.purpurea的性別發(fā)生受一對(duì)等位基因控制，在殼孢子初始萌發(fā)分裂時(shí)，性等位基因隨減數(shù)分裂分離，表現(xiàn)兩性的初始細(xì)胞在同一個(gè)體上各自分別生長(zhǎng)發(fā)育，長(zhǎng)成雌雄組織的嵌合體，表現(xiàn)為雌雄同株、兩性區(qū)域分生的藻體.

對(duì)于P.purpurea性決定機(jī)制的研究，是首次對(duì)紫菜性別發(fā)生機(jī)制的研究工作.由于紫菜屬海藻在性別發(fā)生上的多樣性，僅由性決定機(jī)制解釋顯然是不夠的.華北半葉紫菜（P.katadai var.hemiphylla）、少精紫菜（P.oligo?spermatangia）、壇紫菜（P.haitanensis）和條斑紫菜（P.yezoensis）為我國(guó)沿海常見(jiàn)紫菜物種，其中壇紫菜和條斑紫菜也是人工栽培利用的種類，屬重要經(jīng)濟(jì)海藻.4種紫菜在生殖器官發(fā)生以及性別表現(xiàn)上有明顯差異［6］，對(duì)這些紫菜種類表現(xiàn)的性別特征進(jìn)行比較研究，有助于認(rèn)識(shí)紫菜屬海藻性別發(fā)生的規(guī)律.

1 材料與方法

1.1 藻體性別觀察

華北半葉紫菜：每年春季3～4月青島海區(qū)自然發(fā)生群體達(dá)到盛期，對(duì)數(shù)量較大的藻落進(jìn)行采集，藻體長(zhǎng)3～10cm.采集藻體保濕帶回實(shí)驗(yàn)室，逐一記錄檢測(cè)結(jié)果.

壇紫菜：對(duì)不同區(qū)域自然生長(zhǎng)和人工栽培生長(zhǎng)群體開(kāi)展多批次取樣，統(tǒng)計(jì)樣本數(shù)量＞200株/次，每一藻株除外觀檢測(cè)外還作鏡檢驗(yàn)證，以保證統(tǒng)計(jì)分析的可靠性.野外取樣開(kāi)展進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)觀察，包括成熟藻株和未成熟藻株，培養(yǎng)條件：20±1℃，100μmol m-2s-1，14L:10D，10～25d.

條斑紫菜和少精紫菜：每年春季采集青島海區(qū)成熟藻體，條斑紫菜還包括江蘇沿海人工栽培的藻體，采集藻體的檢測(cè)結(jié)果再由鏡檢逐一確認(rèn).

1.2 藻體早期發(fā)育模式和生長(zhǎng)特點(diǎn)的觀測(cè)

色素突變體誘變獲得方法參照有關(guān)文獻(xiàn)［7］.采集突變型絲狀體成熟釋放的殼孢子，玻片水滴培養(yǎng)，顯微鏡觀測(cè)記錄.重點(diǎn)觀察比較各物種殼孢子萌發(fā)個(gè)體的早期生長(zhǎng)特點(diǎn)和色素突變體標(biāo)記的細(xì)胞組織生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，研究區(qū)分各物種藻體的發(fā)育特征以及與性別表現(xiàn)的關(guān)系.

圖1 華北半葉紫菜性別表現(xiàn)特征

2 結(jié)果

2.1 4種紫菜性別表現(xiàn)特征與性比觀測(cè)

2.1.1 華北半葉紫菜性別表現(xiàn)特征與性比

華北半葉紫菜在青島沿岸海域春季發(fā)生，3～4月為生長(zhǎng)盛期.野外生長(zhǎng)的植株數(shù)毫米大小就可鏡檢觀察到色澤深淺分明的兩種藻體組織，一般以藻體生長(zhǎng)中軸為界，兩側(cè)分生.藻體成熟時(shí)，色澤較深區(qū)域細(xì)胞發(fā)育為果胞和果孢子囊，色澤較淺部分形成精子囊器.其植株雖為雌雄同株，但性別的兩側(cè)分生特征明顯（見(jiàn)圖1）.

對(duì)2005年、2006年生長(zhǎng)盛期采集的所有3cm以上植株進(jìn)行性別觀察分析，獲得3481株，其中雌雄同株3356株，雌株68株，雄株57株，雌、雄性別比例為1∶0.997（表1）.這一結(jié)果表明華北半葉紫菜符合等位性狀分離的數(shù)量關(guān)系.

2.1.2 壇紫菜性別表現(xiàn)特征與性比

壇紫菜藻體秋季發(fā)生，在主產(chǎn)地福建海域的自然生長(zhǎng)群體初冬進(jìn)入生長(zhǎng)盛期，翌年春季衰老流失.人工栽培藻體生長(zhǎng)旺盛期較早，閩浙粵海區(qū)稍有差異，一般為10～12月，但生長(zhǎng)群體衰老時(shí)間也較早于當(dāng)?shù)氐囊吧后w.壇紫菜藻體進(jìn)入快速生長(zhǎng)期后，不同時(shí)期均可采集到成熟植株.成熟植株發(fā)生的生殖細(xì)胞多沿藻體前端邊緣分布，充分成熟的藻體前端部充滿雌或雄的生殖器官，并延伸至藻體中、后部位的邊緣區(qū)域.同一植株一般表現(xiàn)一種性別（圖2A），但仍可觀察到雌雄性別同株的藻體，雌雄同株藻體兩性生殖細(xì)胞有各自的分布區(qū)域，以曲線、直線或斜線分界（圖2B）.

表1 半葉紫菜自然種群藻體性比觀測(cè)

采集2004～2006年不同生長(zhǎng)期的藻株材料進(jìn)行觀察，總數(shù)達(dá)到6411株，獲得成熟植株5050株，其中表現(xiàn)雌性的植株2455株，雄株2581株，雌雄同株14株，性別比例1∶1.05（表2）.觀察結(jié)果顯示，不同批次采集的生長(zhǎng)群體性別比例有所差異，但無(wú)偏性規(guī)律，隨著觀察樣本的增加，其性別比例接近1∶1數(shù)量關(guān)系.

2.1.3 壇紫菜性別發(fā)生特點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)觀察

在野外采集的觀察材料中，每批都有不同比例的未成熟藻體（表2）.隨機(jī)取用部分未成熟藻體（組別1、組別3）進(jìn)行室內(nèi)培養(yǎng)，繼續(xù)觀察其性別發(fā)生特點(diǎn).結(jié)果顯示：較短培養(yǎng)時(shí)間（11～12d）達(dá)到性成熟的藻體不足半數(shù)，其中表現(xiàn)雄性性別的植株數(shù)明顯多于雌性；經(jīng)較長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)（25d）后，多數(shù)藻體可以成熟，雌雄植株比例相等（表3）.這一結(jié)果表明，在同一群體內(nèi)雄性生殖細(xì)胞發(fā)生較早，可能影響性別比例的觀察結(jié)果，但充分成熟的藻體性比仍然具有1∶1關(guān)系，印證了野外生長(zhǎng)群體的觀察結(jié)果.

圖2 壇紫菜性別表現(xiàn)特征

表2 壇紫菜野外生長(zhǎng)藻體性比觀測(cè)

表3 壇紫菜野外未成熟藻體實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)的性比觀測(cè)

繼續(xù)對(duì)野外已成熟的藻體進(jìn)行定株培養(yǎng)觀察（組別1、組別2、組別3、組別4、組別7和組別8），發(fā)現(xiàn)經(jīng)一段培養(yǎng)時(shí)間（11～24d）后，隨著藻株的充分成熟，生殖細(xì)胞向藻體中、后部位延伸，或前端部位生殖細(xì)胞大量放散離體，兩種性別培養(yǎng)植株都出現(xiàn)表現(xiàn)相反性別性狀的個(gè)體，并出現(xiàn)雌雄同株個(gè)體.在培養(yǎng)觀察的1818株藻體中，異性生殖組織出現(xiàn)率為2.1%（表4）.

2.1.4 條斑紫菜和少精紫菜性別表現(xiàn)及其特征觀察

條斑紫菜和少精紫菜自然生長(zhǎng)藻體均在春季發(fā)生，生長(zhǎng)盛期一般為3～4月，少精紫菜旺盛生長(zhǎng)期來(lái)得略遲.人工栽培的條斑紫菜秋季發(fā)生，11月進(jìn)入生長(zhǎng)盛期，直至翌年4月.兩種紫菜進(jìn)入快速生長(zhǎng)期均可觀察到成熟藻體.成熟的條斑紫菜藻體前端及周緣形成很多條紋狀精子囊區(qū)域，鑲嵌在果胞或果孢子囊區(qū)，成為該物種鮮明的特征；少精紫菜成熟初期不易觀察到雄性生殖細(xì)胞，但鏡檢可觀察到小塊的雄性生殖細(xì)胞區(qū)域，充分成熟的藻體在果孢子囊區(qū)域中呈現(xiàn)點(diǎn)狀或小塊狀精子囊器區(qū)（圖3）.

兩種紫菜性別表現(xiàn)的共同特征是，無(wú)論是殼孢子或單孢子萌發(fā)生成的藻體，從未觀察到單一性別表現(xiàn)的植株，兩性生殖細(xì)胞總是在同一植株上發(fā)生，生殖器官形成區(qū)域間生或混生，無(wú)性別組織分生現(xiàn)象，性別表現(xiàn)無(wú)可量的等位關(guān)系.

2.2 4種紫菜藻體早期發(fā)育特點(diǎn)

由突變色素標(biāo)記的雜合絲狀體（2n）成熟后釋放殼孢子，其萌發(fā)分裂個(gè)體顯示遺傳學(xué)機(jī)制的四分子特點(diǎn)（圖4）.表明紫菜葉狀體是具有四分子性質(zhì)的特殊生長(zhǎng)體，由于殼孢子分裂形成的4個(gè)配子生長(zhǎng)體不能自由分離，因而其發(fā)生植株是具有雙親背景或不同遺傳性質(zhì)藻體組織的嵌合體.

在所觀察的4種紫菜物種中，突變色素標(biāo)記的嵌合體顯示，條斑紫菜、壇紫菜和少精紫菜具直線生長(zhǎng)發(fā)育特性；華北半葉紫菜絕大多數(shù)初期分裂個(gè)體為典型的四分子缺失型，由于其第二次分裂頂端細(xì)胞分裂的橫向性，致使生長(zhǎng)個(gè)體表現(xiàn)出兩側(cè)發(fā)育的特性.繼續(xù)培養(yǎng)觀察，可以清晰地看到兩種早期發(fā)育模式對(duì)藻體生長(zhǎng)及形態(tài)建成的影響作用（圖5）.

表4 壇紫菜野外成熟藻體實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)的性比觀測(cè)

圖3 條斑紫菜、少精紫菜性別表現(xiàn)特征

圖4 紫菜殼孢子萌發(fā)分裂表現(xiàn)的四分子

圖5 紫菜生長(zhǎng)藻體兩種基本發(fā)育模式

2.3 4種紫菜性別表現(xiàn)特征比較

綜合野外調(diào)查和實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)果，4種紫菜的性別表現(xiàn)可由表5概括.經(jīng)比較表明：在紫菜物種中有兩種基本的性別類型，可由性比等位關(guān)系與否加以區(qū)別雌、雄同株性別表現(xiàn)在不同類型的物種中，其表現(xiàn)方式與機(jī)制不同，具性比等位關(guān)系的物種，生長(zhǎng)藻體（華北半葉紫菜和壇紫菜）的性別單獨(dú)表達(dá)，或以分生組織表達(dá)，而兩性生殖細(xì)胞間生（混生）的藻體，其物種（條斑紫菜和少精紫菜）性別無(wú)性比等位關(guān)系.

4種紫菜性別特征比較

3 討論

在我國(guó)產(chǎn)的4種紫菜屬海藻中，華北半葉紫菜的性別特征與P.purpurea極為相似［5］.而同具性別等位分離性質(zhì)的壇紫菜，盡管在一些重要的生物學(xué)特征上與華北半葉紫菜、P.purpurea相同，例如有等同的染色體數(shù)［8］，但在性別表現(xiàn)上卻有著重要差異，這也是在紫菜屬海藻性別認(rèn)識(shí)中容易混淆的重要問(wèn)題之一.以P.purpurea為代表物種的性別表現(xiàn)特征是，早期發(fā)育模式具兩側(cè)生長(zhǎng)性，性別區(qū)域主要由殼孢子減數(shù)分裂第二次分裂形成的頂端2細(xì)胞發(fā)育而來(lái)，其雌、雄性別同株的性質(zhì)，是由很高的第二次分裂分離頻率決定的［5］.由于這一類型紫菜植株的營(yíng)養(yǎng)組織可以識(shí)別雌雄性別，明晰的組織區(qū)域標(biāo)記使其生長(zhǎng)發(fā)育特點(diǎn)以及性別決定機(jī)制被直觀地表現(xiàn)出來(lái).從壇紫菜生長(zhǎng)發(fā)育的觀察結(jié)果看，其植株發(fā)生主要以線性生長(zhǎng)為主，由突變色素標(biāo)記的生長(zhǎng)個(gè)體顯示線性四分子特征（圖4）.野生型藻體在生長(zhǎng)過(guò)程中無(wú)營(yíng)養(yǎng)組織區(qū)域標(biāo)記可識(shí)別，僅以藻體成熟部位特別是藻體前端部分發(fā)生的生殖細(xì)胞區(qū)分植株性別，容易在觀察中得到雌雄異株的結(jié)果.繼續(xù)生長(zhǎng)的藻體，特別是雌雄同株藻體，顯示壇紫菜藻體性別表現(xiàn)有先后的時(shí)序，這與其藻體的線性生長(zhǎng)特點(diǎn)相關(guān).野外采集生長(zhǎng)充分但未成熟藻體、以及已成熟藻體的實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)果，可以印證這一結(jié)論.

條斑紫菜和少精紫菜顯示出與性決定機(jī)制不相符合的性別表現(xiàn)特征.從細(xì)胞染色體數(shù)［8］、無(wú)性生殖行為［9］等生物學(xué)特征來(lái)看，這似乎也表明它們代表的是另一類型的紫菜種類.然而，即使可能同屬性分化的物種，其分化的表現(xiàn)形式也有差異.條斑紫菜兩性生殖細(xì)胞區(qū)域作較有規(guī)律的間生分布，而少精紫菜雄性細(xì)胞區(qū)域微小，只在雌性生殖細(xì)胞群中作點(diǎn)狀或小塊狀分布.生殖細(xì)胞區(qū)域的大小，可以由兩性生殖母細(xì)胞分化的早晚、分裂次數(shù)以及生殖器官的結(jié)構(gòu)與形狀等特征決定，但若兩性生殖母細(xì)胞的形成是相同體細(xì)胞分裂的結(jié)果，其性別分化一定與某種調(diào)控規(guī)律有關(guān).

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