陳 秀，韓方璇，黃春新（海南省人民醫(yī)院藥學部，海口市 570102）

甲狀旁腺激素（1-34）（以下簡稱PTH（1-34））注射劑是由美國禮來公司開發(fā)用于治療骨質(zhì)疏松癥的藥物，并于2002年在美國、丹麥和芬蘭等國上市（商品名為Forteo）[1]。PTH（1-34）用于治療具有高風險骨折性的絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥，能增加骨密度并降低脊椎與非脊椎骨折的風險；同時也可以用于提高男性患有原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥或性腺功能減退的骨質(zhì)疏松癥的骨量[2]。該藥治療對象包括具有骨質(zhì)疏松引發(fā)骨折病史的患者，或有多種誘發(fā)骨折的風險及以往的針對骨質(zhì)疏松癥治療方法對其失敗或無法耐受的患者[2～5]。國內(nèi)已有文獻[6]報道PTH（1-34）的含量測定方法，該方法為高效液相色譜（HPLC）法，但存在一定缺陷：（1）分析時間較長，約40 min；（2）以0.1%的三氟乙酸（TFA）乙腈溶液為流動相，酸性較強，pH小于2，易損壞色譜柱；（3）采用梯度洗脫方法，對色譜柱要求較高，且基線不平，峰形不好。為了克服上述分析結(jié)果的缺點，筆者經(jīng)多次篩選，在其基礎上進行改進，最后確定采用在水相中加入鹽、有機相采用甲醇為流動相及等度洗脫的HPLC法，用于測定PTH（1-34）原料藥的含量。結(jié)果表明，該方法的各項方法學研究各項指標均能達到要求。

1 儀器與試藥

UV-260紫外可見分光光度計（日本島津公司）；HP1100型HPLC儀、二極管陣列檢測器（美國惠普公司）。

PTH（1-34）對照品（美國 Peptide公司，批號：M 09245A1，經(jīng)凱氏定氮法測定含量為99.8%）；PTH（1-34）原料藥（杭州諾泰制藥有限公司，批號：090601、090602、090603，經(jīng)凱氏定氮法測定純度分別為98.7%、99.2%、99.6%）；硫酸鈉為分析純，甲醇為色譜純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Spherisorb ODS（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相A為甲醇，流動相B為0.05 mol·L－1Na2SO4水溶液（磷酸調(diào)節(jié)至pH 2.5），A∶B＝30∶70，流速為1.0 mL·min－1；檢測波長為215 nm；柱溫為室溫；進樣量為20 μL。理論板數(shù)按PTH（1-34）峰計算應不低于2 000。

2.2 溶液的制備

供試品溶液：取本品適量加水溶解，稀釋至每1 mL中約含PTH（1-34）0.1 mg的溶液，即得。

對照品溶液：取經(jīng)干燥至恒重的PTH（1-34）對照品適量加水溶解，制備成每1 mL中約含PTH（1-34）0.1 mg的溶液，即得。

2.3 波長的確定

利用紫外-可見分光光度計在190～760 nm波長范圍內(nèi)掃描，結(jié)果表明PTH（1-34）在210、280 nm波長處均有吸收峰。通過二極管陣列檢測器在線掃描發(fā)現(xiàn)主要雜質(zhì)峰在210、280 nm波長處均不明顯，但在215 nm波長處雜質(zhì)峰和主峰都比較明顯，在藥品標準的建立時考慮到有關(guān)物質(zhì)和主藥含量的同時測定，更有利于檢測的方便，故確定測定波長為215 nm。經(jīng)驗證，在該波長下能夠達到含量測定的靈敏度要求。

2.4 流動相的確定

有機流動相的選擇：反相色譜常采用的有機流動相為甲醇和乙腈，甲醇的截止波長（205 nm）和乙腈的截止波長（190 nm）都小于測定波長，但考慮到甲醇價格低廉，所以選甲醇作為有機流動相[7]。

鹽種類的選擇：加入水相中的鹽筆者先后選擇了磷酸鈉、磷酸二氫鈉、氯化銨和醋酸鈉等緩沖鹽并調(diào)節(jié)緩沖鹽的濃度，改變水相與流動相的配比，結(jié)果PTH（1-34）的峰形和分離效果都不好。后來在水相中加入中性鹽硫酸鈉，并用磷酸調(diào)節(jié)pH值，結(jié)果峰形和分離效果得到了很大的改善。為了得到合適的保留時間、最好的峰形和分離效果，進行進一步試驗，試驗內(nèi)容包括流動相的pH值以及水相與有機相的配比。試驗結(jié)果見表1。

表1 流動相的pH值、有機相與水相的配比篩選結(jié)果Tab 1 pH value of mobile phase and proportion screening of water phase and organic phase

從表1可以看出：流動相pH值在2.0時峰形較寬，基線不平，峰形拖尾；流動相pH值為2.5時基線平穩(wěn)，峰形窄，沒有雜質(zhì)峰；當流動相pH值3.0時峰形較寬，而且在3 min左右出現(xiàn)1個小的雜質(zhì)峰，所以水相的pH值最后確定為2.5。

對于流動相比例，當有機相甲醇量為15%、水相量為85%時，主峰保留時間較長，為12.583 min，這樣不僅浪費時間，而且也浪費昂貴的試劑；而當甲醇量增加到35%、水相量減少到65%時，主峰保留時間太短，主峰理論板數(shù)達不到要求，也不利于雜質(zhì)的分離。當甲醇量為30%、水相量為70%時，主峰保留時間適中，理論板數(shù)為8 612，故確定甲醇與水相比例為30∶70。

2.5 系統(tǒng)適用性試驗

取“2.2”項下制備的2種溶液適量，另取1份溶劑適量，均按“2.1”項下色譜條件進樣測定。結(jié)果表明供試品主峰與對照品主峰保留時間一致，另外空白溶劑對色譜條件的分離沒有明顯的影響，3種溶液的色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.空白溶劑；B.對照品；C.供試品；1.PTH（1-34）Fig 1 HPLC chromatogramsA.blank solvent；B.reference substance；C.test sample；1.PTH（1-34）

2.6 線性關(guān)系考察

制備不同濃度 PTH（1-34）溶液：0.06、0.10、0.20、0.40、0.90 mg·mL－1，按“2.10”項下方法測定，記錄圖譜，以進樣濃度（X）為橫坐標，PTH（1-34）峰面積積分值（Y）為縱坐標，繪制標準曲線。計算回歸方程得：Y＝1.323×105X－1.115×102（r＝0.999 97），表明PTH（1-34）檢測濃度的線性范圍為0.06～0.90 mg·mL－1。

2.7 進樣精密度試驗

取樣品適量，加水溶解，制備成0.1 mg·mL－1的溶液，精密吸取20 μL進樣，重復進樣6次，記錄色譜，測定峰面積。結(jié)果，峰面積RSD＝0.15%，表明精密度良好。

2.8 回收率試驗

分別稱取2 mg質(zhì)量80%、100%、120%的PTH（1-34）原料藥，每種標示量各3份樣，按“2.2”項下供試品溶液制備方法分別加水溶解并稀釋至相應濃度，按含量測定方法，測定其回收率。結(jié)果平均回收率為98.6%（RSD＝0.38%），詳見表2。

表2 回收率試驗結(jié)果Tab 2 Results of recovery test

2.9 溶液穩(wěn)定性試驗

取樣品適量，加水溶解，制備成濃度為0.1 mg·mL－1的溶液，分別于制備后第0、2、4、6、12 h進樣分析。結(jié)果，主峰面積積分值的RSD＝0.34%，表明本品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.10 含量測定

取供試品適量，加水溶解，制備成濃度為0.1 mg·mL－1的溶液。精密量取20 μL，注入色譜儀，記錄色譜；另取經(jīng)干燥至恒重的PTH（1-34）對照品適量，加水溶解，制備成濃度為0.1 mg·mL－1的溶液，同法測定，按外標法以峰面積計算，即得。

結(jié)果，3批樣品的標示含量分別為98.1%、98.9%和99.2%，均在95.0%～105.0%之間，符合原料藥質(zhì)量標準要求，說明該色譜分析測定法可控性好。

3 討論

本試驗考察了流動相pH值和流動相配比對基線、峰形和理論板數(shù)的影響，結(jié)果表明，流動相的pH值為2.5、有機相為30%、水相量為70%時，峰形較好，保留時間適中，主峰理論板數(shù)達到要求，表明該方法可行。

綜上所述，本方法簡便、準確、靈敏度高，可用于甲狀旁腺激素（1-34）原料藥含量的測定。

[1]韋 佳.甲狀旁腺激素激動劑特立帕肽[J].藥學進展，2004，28（10）：476.

[2]張 穎，彭永德.骨質(zhì)疏松治療新藥特立帕肽[J].世界臨床藥物，2004，25（12）：725.

[3]孟 萍.甲狀旁腺激素促進骨形成的研究進展[J].中國臨床康復，2004，8（3）：540.

[4]韓志巖，彭錦軒.甲狀旁腺激素治療骨質(zhì)疏松研究進展[J].中國藥理學通報，1997，13（5）：395.

[5]宋彥玉，彭錦軒.甲狀旁腺激素及其受體的藥理學研究[J].中國藥理學通報，1997，13（6）：481.

[6]梁成罡，李克堅，張 慧，等.重組人甲狀旁腺激素的質(zhì)量研究[J].藥物分析雜志，2005，25（2）：215.

[7]李發(fā)美.分析化學[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2007：398.