王生蘭，劉輝琦，曹學(xué)鋒，劉 杰， 吳 穹

(青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，青海 西寧 810001)

血管平滑肌細(xì)胞 (vascular smooth muscle cell，VSMCs)增殖是動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)、血管成型術(shù)后再狹窄等多種心血管疾病的共同病理基礎(chǔ)[1]。近年來大量研究表明，高同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)血癥是造成AS的獨(dú)立的危險(xiǎn)因素，在心、腦血管疾病及外周血管硬化等疾病發(fā)病機(jī)制中起重要作用[2]，其主要分子機(jī)制至今仍不清晰，Hcy促平滑肌細(xì)胞增殖的效應(yīng)被認(rèn)為是其促AS的機(jī)制之一[3，4]。但Hcy對(duì) VSMCs表型轉(zhuǎn)化是否有影響少見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究探討Hcy對(duì)VSMCs增殖和表型轉(zhuǎn)化的影響，為闡明Hcy致AS的發(fā)生機(jī)制提供依據(jù)。

材料和方法

1 材料

SD大鼠由蘭州大學(xué)動(dòng)物中心提供;Ⅰ型膠原酶(collagenaseⅠ)購自 Sigma;胰蛋白酶(trypsin)、DEME/F12干粉狀培養(yǎng)基購自Gibco－BRL;Transzol總RNA提取試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;RT－PCR兩步法試劑盒購自TaKaRa;四甲基偶氮唑鹽[3－(4，5－dimethylthiazol－2－yl)－2，5－diphenyltetrazolium bromide，MTT]和碘化丙啶(propidium iodide，PI)購自Sigma;小牛血清購自杭州四季青生物工程材料研究所;PCR擴(kuò)增引物由Invitrogen合成。

2 大鼠VSMCs的體外培養(yǎng)、鑒定和分組

采用酶消化法分離培養(yǎng)。純種雄性SD大鼠，體重180－220 g，無菌條件下分胸腹主動(dòng)脈，移入超凈臺(tái)，刀背刮去內(nèi)膜，從外膜上撕下中膜，用Ⅰ型膠原酶消化分離 VSMCs。用 DMEM/F12培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱(濕度100%)內(nèi)靜置進(jìn)行原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)。在倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察，并做α－actin肌動(dòng)蛋白免疫組化檢測(cè)。取3－6代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，將細(xì)胞分別置于終濃度為 0、50、100、200、500和1000 μmol/L Hcy的培養(yǎng)液中孵育24 h。

3 細(xì)胞增殖的MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)

分別收集對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，用胰酶消化，制成細(xì)胞懸液 (5 ×1012cells/L)，加入96孔培養(yǎng)板，每孔200 μL，置 5%CO2、37 ℃ 的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng) 24 h后，吸出培養(yǎng)液，分別按分組設(shè)計(jì)加入Hcy液，培養(yǎng)24 h后，每孔加入 20 μL MTT(5 g/L)，置 5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱中作用 4 h，除去上清液，加入150 μL DMSO溶解，平板振蕩儀振蕩10 min，酶聯(lián)免疫儀490 nm波長檢測(cè)各孔吸光度A值。

4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期

細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化后制成細(xì)胞懸液，1000 r/min離心5 min，棄上清，PBS洗滌2次，加入磷酸鹽緩沖液PBS 0.5 mL混懸細(xì)胞。用4#注射針頭將細(xì)胞打入4℃預(yù)冷的盛有乙醇的離心管中(乙醇終濃度為70%)固定，4℃冰箱保存。染色前用PBS洗滌，去除固定液。PI染色，4℃避光30 min，上機(jī)檢測(cè)。

5 RT－PCR法檢測(cè)平滑肌22α(smooth muscle 22 alpha，SM22α)mRNA 的表達(dá)

收集各組細(xì)胞，用Transzol總RNA抽提試劑盒抽提總RNA。取各組細(xì)胞的總RNA各1 μg，按RT－PCR試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，取產(chǎn)物3 μL進(jìn)行PCR循環(huán)(PCR擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性3 min，94 ℃1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，擴(kuò)增30 個(gè)循環(huán)。每份樣本以L19作為內(nèi)參照。引物序列:SM22α(平滑肌 22α，311bp)[5]，正義鏈 5'－ AAG CCA GTG AAG GTG CCT GAG －3'，反義鏈 5'－ TTG AAG GCC AAT CAC GTG CTT－3';L19(ribosomal protein，核糖體蛋白，內(nèi)參照，194 bp)，正義鏈5'－CTG AAG GTC AAA GGG AAT GTG －3'，反義鏈5'－GGA CAG AGT CTT GAT GAT CTC－3'。反應(yīng)后取終產(chǎn)物5 μL在1.2% 瓊脂糖凝膠中電泳分析，紫外線照像。

6 透射電鏡觀察VSMCs形態(tài)學(xué)改變

細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化，在倒置顯微鏡下觀察到細(xì)胞變圓，倒去胰酶，用血清終止消化，PBS洗細(xì)胞2次，加10 mL PBS吹打制成細(xì)胞懸液，移至離心管中，用1500－2000 r/min離心15 min，棄上清，用吸管沿管壁緩慢加入0.5%戊二醛，4℃靜置30 min，用12000 r/min離心15 min，棄上清，用吸管沿管壁緩慢加入3%戊二醛固定液固定后，常規(guī)透射電鏡樣本處理及透射電鏡觀察。

7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 Hcy對(duì)VSMCs增殖的影響

1.1 Hcy對(duì)VSMCs活力的影響 MTT檢測(cè)顯示，不同濃度Hcy作用24 h，隨Hcy濃度增加VSMCs細(xì)胞存活率升高，200 μmol/L、500 μmol/L、1000 μmol/L Hcy組與對(duì)照組(0 μmol/L)相比，差異顯著(P＜0.05)，見表1。

表1 Hcy對(duì)VSMCs活力的影響Table1.Effect of Hcy on VSMCs viability(24 h)(.n=3)

表1 Hcy對(duì)VSMCs活力的影響Table1.Effect of Hcy on VSMCs viability(24 h)(.n=3)

*P ＜0.05 vs control group.

Hcy(μmol/L) A value Cell viability(%)00.0867 ±0.0567 100.0050 0.1117 ±0.0548 128.84100 0.1045 ±0.0515 120.53200 0.1340 ±0.0477 154.56*500 0.1578 ±0.0375 182.01*1000 0.1484 ±0.0565 176.16*

1.2 Hcy對(duì)VSMCs細(xì)胞周期的影響 流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析顯示，0、50、100、200、500、1000 μmol/L Hcy作用 VSMCs 24 h，G0/G1期細(xì)胞逐漸減少(75.60±8.71、75.23 ±0.41、68.20 ±3.52、68.03 ±6.75、65.27 ±7.11、37.73±3.87)，S期細(xì)胞逐漸增多(23.73 ±9.05、20.47 ±5.19、21.23 ±8.51、29.93±10.23、31.80 ±7.45、61.13 ±3.61)，見圖1。

Figure1.Cells in G0/G1stage decrease and in S stage increase with the raising of DNA synthesis affected by Hcy at different concentrations for 24 h.圖1 Hcy對(duì)VSMCs細(xì)胞周期的影響

2 Hcy對(duì)VSMCs表型轉(zhuǎn)化的影響

2.1 Hcy對(duì)VSMCs SM22α mRNA表達(dá)的影響 RT－PCR結(jié)果顯示，隨Hcy濃度增大，SM22α mRNA表達(dá)減少，Hcy 1000 μmol/L 組與對(duì)照組相比(0 μmol/L)差異顯著(P ＜0.01)，見圖2。

Figure2.Effect of Hcy on VSMCs SM22α mRNA expression in VSMCs..n=3.＊＊P＜0.01 vs control(0 μmol/L)group.圖2 Hcy對(duì)VSMCs SM22α mRNA表達(dá)的影響

2.2 Hcy對(duì)VSMCs超微結(jié)構(gòu)的影響 電鏡結(jié)果顯示，對(duì)照組血管平滑肌細(xì)胞為梭形，細(xì)胞內(nèi)可見豐富的肌絲，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基復(fù)合體等細(xì)胞器較少，主要分布于核兩端;200 μmol/L Hcy作用24 h后，細(xì)胞變圓，胞內(nèi)肌絲不明顯，核周圍有大量內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基復(fù)合體，核大，染色質(zhì)疏松，見圖3。

Figure3.Transmission electron microscope revealed contractile phenotype which is plentiful myofilaments，small nucleus，compact chromatin in control group(A)(EM，×10000)and showed synthetic phenotype，which is abundant mitochondrion，rough endoplasmic reticulum and Golgi's complex，puffy chromatin，loose nucleus in VSMCs treated with Hcy at a concentration of 200 μmol/L for 24 h(B)(EM，×4000).圖3 Hcy對(duì)VSMCs超微結(jié)構(gòu)的影響

討 論

近年來大量研究表明，Hcy血癥是造成AS的獨(dú)立的危險(xiǎn)因素，在心、腦血管疾病及外周血管硬化等疾病發(fā)病機(jī)制中起重要作用[2]，關(guān)于高Hcy血癥誘發(fā)AS的機(jī)制尚未完全明了。

在AS形成過程中，動(dòng)脈中膜平滑肌細(xì)胞向內(nèi)皮下遷移，其表型和基因表達(dá)均發(fā)生明顯改變，參與細(xì)胞間質(zhì)合成，脂質(zhì)沉積，斑塊鈣化，并導(dǎo)致血管管壁增厚，因此平滑肌細(xì)胞在AS病變形成和發(fā)展中起重要作用[5]。Hcy與血管平滑肌細(xì)胞增殖有密切關(guān)系。Tsai等[6]用與臨床高Hcy相應(yīng)的劑量作用于離體培養(yǎng)的平滑肌細(xì)胞，結(jié)果表明，Hcy可明顯促進(jìn)DNA合成，最大程度達(dá)4.5倍，同時(shí)可促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白cyclinA及cyclinD mRNA表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞由靜止期進(jìn)入分裂期，從而促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的增殖。本研究顯示，隨Hcy濃度增高，VSMCs細(xì)胞存活率逐漸增加，同時(shí)G0/G1期細(xì)胞比例逐漸降低，而S期細(xì)胞比例明顯升高，DNA合成增加，表明 Hcy可促進(jìn)VSMCs增殖。

VSMCs具有收縮型和合成型2種表型[7]，細(xì)胞表型決定了細(xì)胞的生物學(xué)特性和功能，正常VSMCs是收縮型，VSMCs表型由收縮型向合成型轉(zhuǎn)化是其增生的先決條件。平滑肌22α(smooth muscle 22 alpha，SM22α)蛋白，又稱轉(zhuǎn)凝蛋白(transgelin)，是一個(gè)22 kD的細(xì)胞骨架蛋白，其功能涉及血管平滑肌細(xì)胞的收縮調(diào)節(jié)，被認(rèn)為是收縮表型的標(biāo)志物之一[8]。電鏡下，典型的收縮表型和合成表型的VSMCs應(yīng)具有明顯的形態(tài)、結(jié)構(gòu)區(qū)別。前者核小、染色質(zhì)致密，胞漿富含收縮蛋白、肌絲，而較少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基復(fù)合體等合成、分泌性細(xì)胞器。而后者則核大、染色質(zhì)疏松，少肌絲，但卻富含合成、分泌性細(xì)胞器[9]。本實(shí)驗(yàn)中，不同濃度Hcy作用下SM22α的表達(dá)下調(diào)，Hcy濃度增至1000 μmol/L時(shí)差異顯著。同時(shí)200 μmol/L Hcy作用24 h后，VSMCs細(xì)胞中線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基復(fù)合體明顯增多，胞核大、染色質(zhì)疏松，呈現(xiàn)合成表型的特征。因此，本研究顯示，同型半胱氨酸在促進(jìn)VSMCs增殖的同時(shí)可促進(jìn)其表型轉(zhuǎn)化。

絲裂素活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases，MAPK)是引起細(xì)胞增殖反應(yīng)的細(xì)胞外信號(hào)向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)的共同通路，通過磷酸化而活化，Woo等[10]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)臨床高Hcy刺激牛平滑肌細(xì)胞增殖，且用MAPK磷酸化抑制劑可抑制Hcy誘導(dǎo)的MAPK磷酸化及平滑肌細(xì)胞增殖，說明Hcy刺激牛平滑肌細(xì)胞增殖的過程中包含了MAPK磷酸化的激活。VSMCs的表型轉(zhuǎn)換受一系列復(fù)雜的信號(hào)分子和環(huán)境因素整合效應(yīng)的影響。Karra等[11]研究顯示，可能有數(shù)百個(gè)基因的改變參與了表型轉(zhuǎn)換和AS的早期進(jìn)展，涉及表型轉(zhuǎn)換相關(guān)的基因多為轉(zhuǎn)錄因子編碼基因，而涉及 AS早期進(jìn)展的基因則多與脂質(zhì)代謝相關(guān)。目前最受人關(guān)注的順式調(diào)控元件為CArG，CArG元件的啟動(dòng)幾乎為SMCs所有分化標(biāo)志基因的表達(dá)所必需。該序列是轉(zhuǎn)錄因子血清反應(yīng)因子(serum response factor，SRF)的結(jié)合位點(diǎn)，SRF與 CArG的結(jié)合即激活一些早期基因促進(jìn)細(xì)胞的生長和增殖，如 c－fos;也激活促進(jìn)細(xì)胞分化的基因，如 SM－αactin、SM－MHC和肌動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白(SM22－actin，SM22 α)等。Owens等[12]發(fā)現(xiàn)，凝血酶和胎牛血清在引起SMCs增殖的同時(shí)并不影響 VSMCs的 SM－α－actin等分化基因的表達(dá)。Su等[13]在觀察活性氧對(duì)VSMCs分化的調(diào)節(jié)機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)，活性氧通過p38MAPK信號(hào)通路促進(jìn) VSMCs的分化。因此，SMCs增殖的調(diào)控與 SMCs分化、或表型轉(zhuǎn)換的調(diào)控雖然緊密相關(guān)，但并不完全呈此消彼長的關(guān)聯(lián)方式。同型半胱氨酸引起VSMCs表型轉(zhuǎn)化是否通過MAPK通路，其分子機(jī)制如何，有待進(jìn)一步研究。

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