王 川，張少玲，嚴(yán) 勵(lì)，程 樺

(中山大學(xué)附屬第二醫(yī)院內(nèi)分泌科，廣東 廣州 510120)

不適當(dāng)升高的醛固酮水平可引起心血管損害[1]。與同等血壓的原發(fā)性高血壓患者相比，原發(fā)性醛固酮增多癥患者心血管損傷發(fā)生早、程度重，且這種現(xiàn)象不能單用醛固酮引起水鈉潴留和血壓升高等效應(yīng)來(lái)解釋[2]，因此還存在其它機(jī)制導(dǎo)致高醛固酮血癥對(duì)機(jī)體的損害。醛固酮和脂肪細(xì)胞間存在交互作用:醛固酮可促進(jìn)脂肪細(xì)胞的分化，而脂肪細(xì)胞分泌的某些因子可促進(jìn)醛固酮的合成和分泌[3，4]。內(nèi)脂素是脂肪細(xì)胞分泌的一種因子，它參與炎癥、氧化應(yīng)激和內(nèi)皮損傷等多種生理病理反應(yīng)[5]，而且2型糖尿病患者內(nèi)脂素水平與醛固酮水平呈負(fù)相關(guān)[6]，這些研究提示醛固酮可能通過(guò)調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞內(nèi)脂素的表達(dá)和分泌，參與高醛固酮血癥對(duì)心血管的損傷。本實(shí)驗(yàn)體外培養(yǎng)3T3－L1前脂肪細(xì)胞和脂肪細(xì)胞，研究醛固酮對(duì)內(nèi)脂素基因表達(dá)和蛋白分泌的影響及其可能機(jī)制。

材料和方法

1 細(xì)胞與試劑

3T3－L1前脂肪細(xì)胞(ATCC)、DMEM高糖培養(yǎng)基(Gibco)、醛固酮、安體舒通、3－異丁基－1－甲基黃嘌呤、油紅 O(Sigma)，Trizol(Invitrogen)，SYBR PrimeScriptTMRT－PCR試劑盒(TaKaRa)，PCR引物(寶生物工程有限公司設(shè)計(jì)并合成)，內(nèi)脂素檢測(cè)試劑盒(USCN＆LIFE)。

2 細(xì)胞培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化

3T3－L1前脂肪細(xì)胞按1.5×105cells/cm2密度接種于6孔板，用含10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、25 mmol/L DMEM高糖培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，每2 d更換培養(yǎng)液1次，細(xì)胞接觸抑制2 d后，換用含0.5 mmol/L 3－異丁基－1－甲基黃嘌呤、1.7 μmol/L胰島素、1 μmol/L地塞米松和10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)2 d，再換用1.7 μmol/L胰島素和10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)2 d，以后用10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)直到細(xì)胞分化為成熟脂肪細(xì)胞。每天在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)分化情況，誘導(dǎo)后約6－8 d細(xì)胞分化成熟。此時(shí)可行油紅O染色進(jìn)行脂肪細(xì)胞鑒定。

3 實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)分為5組，分別為:(1)對(duì)照組(control):含25 mmol/L葡萄糖的DMEM高糖培養(yǎng);(2)低醛固酮組(low aldosterone，LA);(3)高醛固酮組(high aldosterone，HA):分別含10－8和10－6mol/L 醛固酮;(4)低醛固酮+安體舒通組(low aldosterone plus spironolactone，LA+SP);(5)高醛固酮+安體舒通組(high aldosterone plus spironolactone，HA+SP):分別含10－8和10－6mol/L醛固酮加10－6mol/L鹽皮質(zhì)激素受體拮抗劑－安體舒通。每組再分為2亞組:3T3－L1前脂肪細(xì)胞和脂肪細(xì)胞組，前脂肪細(xì)胞選擇細(xì)胞融合80%左右的進(jìn)行干預(yù)，脂肪細(xì)胞為成脂誘導(dǎo)第6 d的細(xì)胞，此時(shí)大約有80%的前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化成熟，每組分別處理24 h和48 h，重復(fù)3次。

4 實(shí)時(shí)RT－PCR檢測(cè)內(nèi)脂素和鹽皮質(zhì)激素受體(mineralocorticoid receptor，MR)mRNA的水平

用Trizol分別提取每組總RNA，紫外分光光度法測(cè)定RNA濃度和純度。實(shí)時(shí)RT－PCR按SYBR PrimeScriptTMRT－PCR kit的操作說(shuō)明進(jìn)行，首先1 μg總RNA為模板，反應(yīng)體積20 μL進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件為37℃ 15 min，85℃ 5 s。再以RT產(chǎn)物為模板，用SYBR green染料法進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR(ABI PRISM 7000實(shí)時(shí)PCR儀)擴(kuò)增目的片段，測(cè)定內(nèi)脂素和MR mRNA表達(dá)，18S作為內(nèi)參照。引物序列如下:內(nèi)脂素正向5'－TACTGTGGCGGGAATTGCTCTAA －3'，反向5'－CCACAGACACAGGCACTGATGA－3';MR正向5'－ CTTCAGTTCGTGCGGCTTCA －3'，反向 5'－AGAACCTCTGCCAACTCTGTCCA－3';18S正向5'－CAACACGGGAAACCTCACC－3'，反向 5'－CAGACAAATCGCTCCACCAA －3'，引物濃度 10 μmol，反應(yīng)體積20 μL。PCR采用兩步法，第一步95℃預(yù)變性10 s，第二步95 ℃ 5 s，60 ℃ 31 s，共40 個(gè)循環(huán)，目標(biāo)基因與18S mRNA進(jìn)行比較，用ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)量。反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)擴(kuò)增曲線和溶解曲線。

5 酶聯(lián)免疫法檢測(cè)內(nèi)脂素水平

取細(xì)胞培養(yǎng)上清液100 μL，按試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)量?jī)?nèi)脂素的濃度。每孔均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔吸光度值，根據(jù)樣品的吸光度值由標(biāo)準(zhǔn)曲線得出相應(yīng)的濃度(μg/L)。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 細(xì)胞形態(tài)及內(nèi)脂素基因表達(dá)和分泌變化

隨著3T3－L1前脂肪細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化，細(xì)胞由梭型或不規(guī)則型逐漸變圓變大，胞內(nèi)可見(jiàn)串珠狀可被油紅O染成鮮紅的脂滴，見(jiàn)圖1。

Figure1.3T3－L1 adipocytes stained with oil red O(×200).圖1 油紅O染色后的3T3－L1脂肪細(xì)胞

隨著3T3－L1前脂肪細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化，內(nèi)脂素mRNA的表達(dá)增加，誘導(dǎo)第6 d和第7 d較前脂肪細(xì)胞對(duì)照分別增加了4.3倍和7.3倍(P＜0.05)。

3T3－L1前脂肪細(xì)胞培養(yǎng)液中內(nèi)脂素濃度低，無(wú)法測(cè)到，但脂肪細(xì)胞培養(yǎng)液中內(nèi)脂素濃度隨誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)明顯增高，誘導(dǎo)第6 d和第7 d分別為(70.02±9.28)μg/L和(95.20±8.17)μg/L。

2 醛固酮對(duì)前脂肪細(xì)胞內(nèi)脂素基因表達(dá)和蛋白分泌的影響

醛固酮作用前脂肪細(xì)胞24 h，LA和HA組內(nèi)脂素mRNA的表達(dá)較同一時(shí)間對(duì)照組分別減少48.0%和52.0%，P＜0.05;作用48 h，分別減少49.4%和46.6%，P＜0.05，但與醛固酮濃度無(wú)關(guān)(LA vs HA，P＞0.05)。聯(lián)用安體舒通48 h，LA+SP內(nèi)脂素mRNA表達(dá)高于LA，P＜0.05，但仍低于對(duì)照組(P＜0.05)，見(jiàn)圖2。無(wú)論有無(wú)聯(lián)用安體舒通，醛固酮干預(yù)后，3T3－L1前脂肪細(xì)胞培養(yǎng)液中內(nèi)脂素濃度仍未測(cè)到。

Figure2.The expression of visfatin mRNA in 3T3－L1 preadipocytes after aldosterone treatment for 24 h and 48 h..n=3.*P＜0.05 vs control at the same time;◇P ＜0.05 vs LA at the same time.圖2 醛固酮作用24 h和48 h 3T3－L1前脂肪細(xì)胞內(nèi)脂素mRNA表達(dá)變化

3 醛固酮對(duì)脂肪細(xì)胞內(nèi)脂素基因表達(dá)和蛋白分泌的影響

醛固酮作用脂肪細(xì)胞24 h，LA和HA組內(nèi)脂素mRNA的表達(dá)較對(duì)照組分別降低43.5%和51.2%，P＜0.05，培養(yǎng)液中脂聯(lián)素濃度分別減少48.4%和47.1%，P＜0.05;作用48 h，內(nèi)脂素mRNA的表達(dá)降低39.7%和48.6%，P＜0.05，脂聯(lián)素濃度分別減少57.7%和56.1%，P＜0.05，以上變化均與醛固酮的濃度無(wú)關(guān)(LA vs HA，P ＞0.05)，見(jiàn)圖3、4。

聯(lián)用安體舒通，LA+SP的內(nèi)脂素mRNA的表達(dá)以及培養(yǎng)液中蛋白濃度均高于LA(P＜0.05)，其中蛋白濃度仍然低于同一時(shí)間對(duì)照組(P＜0.05);HA+SP的內(nèi)脂素mRNA的表達(dá)以及蛋白濃度低于同一時(shí)間對(duì)照組(P＜0.05)，但與HA比較差異無(wú)顯著。

4 醛固酮對(duì)前脂肪細(xì)胞和脂肪細(xì)胞MR基因表達(dá)的影響

3T3－L1脂肪細(xì)胞MR基因表達(dá)較前脂肪細(xì)胞降低，誘導(dǎo)第6 d和第7 d分別降低30%和55%，P ＜0.05。

醛固酮作用前脂肪細(xì)胞48 h，LA的MR mRNA表達(dá)高于同一時(shí)間對(duì)照組(P＜0.05)，見(jiàn)圖5;作用于脂肪細(xì)胞無(wú)論24 h還是48 h，LA和HA的MR mRNA表達(dá)均高于同一時(shí)間對(duì)照組(P＜0.05)，見(jiàn)圖6。

Figure3.The expression of visfatin mRNA in 3T3－L1 adipocytes after aldosterone treatment for 24 h and 48 h..n=3.*P＜0.05 vs control at the same time;◇P＜0.05 vs LA at the same time.圖3 醛固酮作用24 h和48 h脂肪細(xì)胞內(nèi)脂素mRNA表達(dá)變化

Figure4.The visfatin concentration in 3T3－L1 adipocytes after aldosterone treatment for 24 h and 48 h..n=3.*P＜0.05 vs control at the same time;◇P＜0.05 vs LA at the same time;#P＜0.05 vs HA at the same time.圖4 醛固酮作用24 h和48 h脂肪細(xì)胞內(nèi)脂素濃度變化

Figure5.The expression of MR mRNA in 3T3－L1 preadipocytes after aldosterone treatment for 24 h and 48 h..n=3.*P＜0.05 vs control at the same time.圖5 醛固酮作用24 h和48 h 3T3－L1前脂肪細(xì)胞MR mRNA表達(dá)變化

聯(lián)用安體舒通，無(wú)論前脂肪細(xì)胞還是脂肪細(xì)胞，LA+SP和HA+SP的MR mRNA表達(dá)與對(duì)照組比差異無(wú)顯著(P＞0.05)。

Figure6.The expression of MR mRNA in adipocytes after aldosterone treatment for 24 h and 48 h..n=3.*P＜0.05 vs control at the same time;◇P＜0.05 vs LA at the same time;#P ＜0.05 vs HA at the same time.圖6 醛固酮作用24 h和48 h脂肪細(xì)胞MR mRNA表達(dá)變化

討 論

本研究用10－8和10－6mol/L醛固酮干預(yù)3T3－L1脂肪細(xì)胞24 h和48 h，內(nèi)脂素基因表達(dá)降低，同時(shí)培養(yǎng)液中的蛋白濃度下降，由此可見(jiàn)醛固酮可抑制脂肪細(xì)胞內(nèi)脂素的基因表達(dá)和分泌。

醛固酮和脂肪細(xì)胞間存在交互作用:醛固酮可促進(jìn)脂肪細(xì)胞的分化，而脂肪細(xì)胞分泌的某些因子可促進(jìn)醛固酮的合成和分泌[3，4]。在超重的原發(fā)性高血壓患者中體重指數(shù)與血醛固酮水平呈正比;體重減輕后，醛固酮水平下降[7]。此外，Wada 等[8]觀察到醛固酮作用于3T3－L1脂肪細(xì)胞可抑制胰島素誘導(dǎo)的葡萄糖攝取。結(jié)合本研究結(jié)果可見(jiàn)無(wú)論體內(nèi)還是體外，醛固酮均可影響脂肪細(xì)胞的功能。

內(nèi)脂素是一種由脂肪細(xì)胞分泌的脂肪細(xì)胞因子，與炎癥、氧化應(yīng)激、血管內(nèi)皮損傷和心肌纖維化等有著密切的聯(lián)系。2型糖尿病患者醛固酮水平與內(nèi)脂素水平呈負(fù)相關(guān)[6]，而安體舒通可增加糖尿病腎病患者內(nèi)脂素水平[9]。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示血管緊張素Ⅱ可抑制體外培養(yǎng)的人脂肪細(xì)胞內(nèi)脂素mRNA表達(dá)，而血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑可增加內(nèi)脂素mRNA表達(dá)[10]。因此我們推測(cè)醛固酮抑制脂肪細(xì)胞內(nèi)脂素的基因表達(dá)和分泌，可能參與了其對(duì)心腎等臟器損害。

本實(shí)驗(yàn)還觀察到醛固酮促進(jìn)MR基因表達(dá)，而安體舒通可對(duì)抗醛固酮這種作用。醛固酮可與MR特異結(jié)合，醛固酮水平的變化能引起細(xì)胞內(nèi)MR數(shù)量的改變，并且不同疾病狀態(tài)和不同細(xì)胞MR變化趨勢(shì)不一致。醛固酮可降低大鼠循環(huán)中單核細(xì)胞MR的數(shù)量，而對(duì)B和T淋巴細(xì)胞MR的數(shù)量無(wú)影響。在糖尿病患者中，低醛固酮水平伴隨著單核細(xì)胞MR表達(dá)的上升;相反，在妊高征的患者中，低醛固酮血癥卻降低單核細(xì)胞MR的表達(dá)[11]。而本研究中醛固酮促進(jìn)了脂肪細(xì)胞MR基因的表達(dá)。

MR是核受體家族的一員，近年來(lái)，MR的作用日益受到重視。MR不僅維持水鈉平衡，還與心血管重構(gòu)、行為認(rèn)知以及脂肪分化等病理生理反應(yīng)有關(guān)。細(xì)胞內(nèi)MR數(shù)量的變化可引起功能的改變，在小鼠前腦選擇性地敲除MR，會(huì)損傷小鼠的空間學(xué)習(xí)能力;相反，在前腦選擇性地過(guò)表達(dá)MR，會(huì)導(dǎo)致小鼠應(yīng)激后焦慮樣行為的減少[12]。在小鼠心肌細(xì)胞上過(guò)度表達(dá)MR可引起離子通道重建，心室復(fù)極延長(zhǎng)，導(dǎo)致嚴(yán)重室性心律失常[13]。激活MR可促進(jìn)前脂肪細(xì)胞分化為成熟的脂肪細(xì)胞[14]。此外，MR拮抗劑－安體舒通可增加肥胖糖尿病小鼠脂肪組織[15]和糖尿病腎病患者[9]內(nèi)脂素水平。結(jié)合本研究結(jié)果:聯(lián)用安體舒通，醛固酮對(duì)3T3－L1脂肪細(xì)胞內(nèi)脂素基因表達(dá)和分泌的抑制作用減弱，提示MR與脂肪細(xì)胞的功能有著密切聯(lián)系。

總之，本研究顯示醛固酮可抑制3T3－L1脂肪細(xì)胞內(nèi)酯素的基因表達(dá)和分泌，提示脂肪細(xì)胞及其分泌的內(nèi)脂素可能參與了高醛固酮對(duì)機(jī)體的損傷，這為我們治療高醛固酮血癥帶來(lái)的危害提供了一種新的思路，但體內(nèi)情況如何尚需進(jìn)一步研究。

[1]田曉虹，曲 鵬，夏稻子，等.Goldblatt大鼠心肌組織和血漿醛固酮變化及其valsartan對(duì)左室肥厚和心功能的影響[J].中國(guó)病理生理雜志，2000，16(10):950.

[2]Bochud M，Nussberger J，Bovet P，et al.Plasma aldosterone is independently associated with the metabolic syndrome[J].Hypertension，2006，48(2):239 －245.

[3]Jeon JH，Kim KY，Kim JH，et al.A novel adipokine CTRP1 stimulates aldosterone production[J].FASEB J，2008，22(5):1502 －1511.

[4]Schinner S，Willenberg HS，Krause D，et al.Adipocyte－derived products induce the transcription of the StAR promoter and stimulate aldosterone and cortisol secretion from adrenocortical cells through the Wnt－signaling pathway[J].Int J Obes(Lond)，2007，31(5):864 － 870.

[5]Sommer G，Garten A，Petzold S，et al.Visfatin/PBEF/Nampt:structure，regulation and potential function of a novel adipokine[J].Clin Sci(Lond)，2008，115(1):13－23.

[6]Takebayashi K，Suetsugu M，Wakabayashi S，et al.Association between plasma visfatin and vascular endothelial function in patients with type 2 diabetes mellitus[J].Metabolism，2007，56(4):451 －458.

[7]Dall'Asta C，Vedani P，Manunta P，et al.Effect of weight loss through laparoscopic gastric banding on blood pressure，plasma renin activity and aldosterone levels in morbid obesity[J].Nutr Metab Cardiovasc Dis，2009，19(2):110－114.

[8]Wada T，Ohshima S，F(xiàn)ujisawa E，et al.Aldosterone inhibits insulin－induced glucose uptake by degradation of insulin receptor substrate(IRS)1 and IRS2 via a reactive oxygen species－mediated pathway in 3T3－L1 adipocytes[J].Endocrinology，2009，150(4):1662 －1669.

[9]Matsumoto S，Takebayashi K，Aso Y.The effect of spironolactone on circulating adipocytokines in patients with type 2 diabetes mellitus complicated by diabetic nephropathy[J].Metabolism，2006，55(12):1645 －1652.

[10]Storka A，Vojtassakova E，Mueller M，et al.Angiotensin inhibition stimulates PPAR gamma and the release of visfatin[J].Eur J Clin Invest，2008，38(11):820 －826.

[11]Wacker J，E －Mistry N，Bauer H，et al.Mineralocorticoids and mineralocorticoid receptors in mononuclear leukocytes in patients with pregnancy－induced hypertension[J].J Clin Endocrinol Metab，1992，74(4):910 －913.

[12]Kolber BJ，Wieczorek L，Muglia LJ.Hypothalamic－ pituitary－adrenal axis dysregulation and behavioral analysis of mouse mutants with altered glucocorticoid or mineralocorticoid receptor function[J].Stress，2008，11(5):321－338.

[13]Ouvrard－Pascaud A，Sainte－Marie Y，Benitah JP，et al.Conditional mineralocorticoid receptor expression in the heart leads to life － threatening arrhythmias[J].Circulation，2005，111(23):3025 －3033.

[14]Caprio M，F(xiàn)eve B，Claes A，et al.Pivotal role of the mineralocorticoid receptor in corticosteroid－induced adipogenesis[J].FASEB J，2007，21(9):2185 －2194.

[15]Guo C，Ricchiuti V，Lian BQ，et al.Mineralocorticoid receptor blockade reverses obesity－related changes in expression of adiponectin，peroxisome proliferator－activated receptor－ gamma，and proinflammatory adipokines[J].Circulation，2008，117(17):2253－2261.