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(贛南醫(yī)學(xué)院,江西贛州 341000)

染料木素(Gen)為異黃酮的一種,被認(rèn)為在女性心血管疾病、乳腺癌、更年期潮熱、絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的預(yù)防和治療中具有重要作用。此外,還具有抗氧化、抗衰老、抗真菌、抑制真菌活性及酪氨酸蛋白激酶活性的功能[1]。2009年 1～7月,我們針對(duì)Gen對(duì)心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及機(jī)制進(jìn)行初步探討。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 動(dòng)物 SD大鼠 40只,體質(zhì)量(220±20)g,雌雄各半,由江西中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 試劑與儀器 Gen由沈陽(yáng)藥科大學(xué)植化室提供,純度 99%,注射用水 +二甲基亞砜(DMSO)(7:3)配成所需濃度;乳酸脫氫酶(LDH)、磷酸肌酸激酶(CK)、丙二醛(MDA)及超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。BL-420S生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)為成都泰盟儀器有限公司生產(chǎn)。AG135型光電天平,中佳 KLC-2046型低速冷凍離心機(jī),721-分光光度計(jì)為上海精密科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)。

1.3 動(dòng)物模型的建立及分組[2]將 40只 SD大鼠腹腔注射烏拉坦(1.2 g/kg),麻醉后記錄Ⅱ?qū)?lián)心電圖(ECG),氣管插管,在左側(cè)第 3～4肋間開(kāi)胸,剪開(kāi)心包,暴露心臟,于肺動(dòng)脈圓錐與左心房中間找出冠狀動(dòng)脈左前降支,并用圓形無(wú)創(chuàng)縫合針 6/0絲線置于左冠狀動(dòng)脈前降支起始部下 2mm處備用。將手術(shù)后的大鼠隨機(jī)分為 5組,分別為缺血模型組、陰性對(duì)照組、Gen高劑量組(10mg/kg)、Gen中劑量組(5mg/kg)、Gen低劑量組(2.5 mg/kg)。除陰性對(duì)照組僅穿線不結(jié)扎外,其余各組均以 0號(hào)線立即結(jié)扎。結(jié)扎冠狀動(dòng)脈,以 ECGⅡ?qū)?lián) ST段抬高 0.1 mV或 T波高聳、心肌顏色變暗紅色為結(jié)扎成功的標(biāo)志。于結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支后第 10分鐘經(jīng)舌下靜脈注射各濃度 Gen溶液,模型組及陰性對(duì)照組經(jīng)舌下靜脈注入等體積溶劑,結(jié)扎 40min后恢復(fù)供血 60min造成在體缺血再灌注。

1.4 Ⅱ?qū)?lián) ECG T波幅度變化值 造模成功后記錄全程Ⅱ?qū)?lián) ECG,觀察實(shí)驗(yàn)各組結(jié)扎前后 0、1、5、10、20、30 min T波幅度值。

1.5 生化指標(biāo)檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,左心室心內(nèi)穿刺取血,分離血清測(cè)定血清中 LDH、CK、MDA、SOD值。操作步驟按南京建成生物工程研究所試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.6 免疫組化染色 Bcl-2、Bax、Caspase-3抗體為北京中山生物技術(shù)公司產(chǎn)品。取上述石蠟標(biāo)本相應(yīng)部位的連續(xù)切片各 3張,常規(guī)脫蠟至水,以 Bcl-2、Bax、Caspase-3抗體為一抗進(jìn)行免疫組化 SP染色,按說(shuō)明書操作。DAB顯色,蘇木精對(duì)比染色,中性樹(shù)膠封片鏡檢。以細(xì)胞核染成棕色的細(xì)胞為陽(yáng)性細(xì)胞,根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞分布情況,在 40×高倍鏡視野下,每張切片隨機(jī)選擇 10個(gè)視野,每個(gè)視野計(jì)數(shù) 100個(gè)細(xì)胞。計(jì)算平均陽(yáng)性細(xì)胞率(陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù) ×100%)作為陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)指數(shù)(PEI)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 Prism 4.0統(tǒng)計(jì)軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),兩樣本均數(shù)比較用 t檢驗(yàn),兩組樣本率比較用Fishers確切概率法,以 P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Gen對(duì)心肌缺血 T波幅度值變化的影響 見(jiàn)表1。

2.2 Gen對(duì)心肌缺血再灌注損傷后血清中各生化指標(biāo)含量的影響 見(jiàn)表2。

3.3 Gen對(duì)凋亡相關(guān)蛋白 Bcl-2、Bax、Caspase-3表達(dá)的影響 見(jiàn)表3。

表1 Gen對(duì)心肌缺血 T波幅度值變化的影響(mV,±s)

表1 Gen對(duì)心肌缺血 T波幅度值變化的影響(mV,±s)

注:與模型組比較,*P＜0.05,△P＜0.01

組別 0m in 1min 5min 10m in 20min 30m in模型組 0.27±0.08 0.46±0.09 0.47±0.07 0.50±0.11 0.43±0.04 0.46±0.10陰性對(duì)照組 0.21±0.06 0.22±0.09△ 0.22±0.09△ 0.24±0.05△ 0.23±0.07△ 0.24±0.08△Gen高劑量組 0.24±0.06 0.44±0.12 0.58±0.08 0.23±0.07△ 0.24±0.09△ 0.26±0.06△Gen中劑量組 0.26±0.06 0.36±0.10 0.53±0.05 0.31±0.07* 0.23±0.10△ 0.32±0.04 Gen低劑量組 0.24±0.07 0.35±0.09 0.52±0.13 0.31±0.06* 0.33±0.09 0.37±0.07

表2 Gen對(duì)心肌缺血再灌注損傷后血清中各生化指標(biāo)含量的影響(±s)

表2 Gen對(duì)心肌缺血再灌注損傷后血清中各生化指標(biāo)含量的影響(±s)

注:與模型組比較,*P＜0.05;與陰性對(duì)照組比較,△P＜0.05

組別 LDH含量(U/L) CK含量(U/L) MDA含量(nmol/ml) SOD含量(U/m l)模型組 1631.57±440.79△ 1301.71±790.86△ 9.23±0.45△ 295.25±28.60△陰性對(duì)照組 792.12±187.68 533.62±103.25 5.36±1.05 348.67±34.39 Gen高劑量組 829.62±422.83* 518.75±274.77* 5.44±0.27* 341.51±41.64*Gen中劑量組 984.28±327.29* 812.57±278.00* 6.97±1.25* 329.54±36.18*Gen低劑量組 1502.00±454.06△ 1236.69±523.84△ 6.75±1.85* 310.63±34.40

表3 Gen對(duì)凋亡相關(guān)蛋白 Bcl-2、bax、caspase-3表達(dá)的影響(±s)

表3 Gen對(duì)凋亡相關(guān)蛋白 Bcl-2、bax、caspase-3表達(dá)的影響(±s)

注:與模型組比較,*P＜0.05,△P＜0.01;與陰性對(duì)照組比較,#P＜0.01

組別 Caspase-3 Bax Bcl-2模型組 65.3±13.1# 57.6±8.9# 17.9±6.2陰性對(duì)照組 10.1±3.5△ 7.6±2.1△ 23.7±4.5 Gen高劑量組 20.5±2.3△ 16.3±5.1△ 38.1±6.3*Gen中劑量組 28.7±4.6△ 20.7±3.5△ 39.2±5.3*Gen低劑量組 45.7±1.5* 38.6±5.3* 36.7±2.5*

3 討論

大量研究表明,心肌缺血一定時(shí)間后恢復(fù)灌注,氧自由基含量突然明顯增加,內(nèi)源性抗氧化酶系統(tǒng)活性降低,其中以SOD活性降低最為明顯[3]。氧自由基的增加主要與再灌注時(shí)黃嘌呤氧化酶的激活、中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)、呼吸鏈電子傳遞障礙以及兒茶酚胺釋放增多等因素有關(guān)。因抗氧化酶系統(tǒng)活性下降,無(wú)法清除過(guò)多的氧自由基,從而引發(fā)強(qiáng)烈的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng),破壞脂質(zhì)細(xì)胞膜,導(dǎo)致組織細(xì)胞的損傷[4]。Caspase-3可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)重要蛋白質(zhì)降解失活及DNA斷裂,是細(xì)胞凋亡的主要效應(yīng)因子[5]。Bcl-2家族是一類主要的凋亡調(diào)控基因,包括 Bcl-2、Bax等,Bcl-2促進(jìn)細(xì)胞生存,抑制細(xì)胞凋亡,而 Bax促進(jìn)細(xì)胞凋亡[6]。

本研究表明,Gen對(duì)缺血再灌注心肌具有明顯的保護(hù)作用,Gen能明顯降低血清中 LDH和 CK活性,LDH和CK活性常用來(lái)反映心肌受損的程度,說(shuō)明Gen能降低心肌的損害程度。而心肌缺血再灌注損傷時(shí),氧自由基大量生成,且對(duì)自由基的清除能力也大大降低,從而造成大量自由基蓄積,引起心肌組織的嚴(yán)重?fù)p傷。Gen能降低心肌缺血再灌注損傷大鼠血清 MDA含量,升高 SOD活性,提示 Gen可能是通過(guò)抑制脂質(zhì)過(guò)氧化酶,抑制脂質(zhì)過(guò)氧過(guò)程,并同時(shí)提高內(nèi)源性抗氧化酶活性而減輕氧自由基對(duì)心肌的損傷。Gen能使缺血再灌注后的心肌組織中 Bcl-2蛋白表達(dá)增加,而 Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)降低,說(shuō)明 Gen減少心肌細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能與調(diào)節(jié)凋亡的相關(guān)基因Bcl-2、Bax、和 Caspase-3蛋白表達(dá)有關(guān)。

[1]余燕影,胡昕,曹樹(shù)穩(wěn),等.染料木素 7,4-二-β-D-吡喃葡萄糖苷的合成[J].化學(xué)研究與應(yīng)用,2007,19(3):323-326.

[2]朱志軍,劉偉華,王俊科.芬太尼、脂多糖預(yù)處理對(duì)缺血再灌注損傷大鼠心肌的保護(hù)作用及機(jī)制探討[J].山東醫(yī)藥,2007,47(18):18-19.

[3]郭來(lái)敬,張志仁,陳東輝,等.電子順磁共振檢測(cè)心肌缺血再灌產(chǎn)生的氧自由基及其保護(hù)的實(shí)驗(yàn)研究[J].心肺血管病雜志,2000,19(1):58-60.

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