石貴玉，李佳枚，韋 穎，廖文雪，葉 靜

(1.廣西師范大學 生命科學學院，廣西 桂林 541004;2.廣西環(huán)境工程與保護評價重點實驗室，廣西 桂林 541004)

隨著礦產(chǎn)資源大量開發(fā)利用，各種化學產(chǎn)品、農(nóng)藥、化肥的廣泛使用以及城市污泥、污水的農(nóng)業(yè)利用，重金屬對土壤、水體的污染也越來越嚴重［1－2］。在主要的重金屬污染物中，鎘 (Cd) 有比較高的生物毒性，Cd對高等植物的毒害作用主要表現(xiàn)為抑制植物對水分的吸收和運輸;抑制光合作用和呼吸作用;抑制其它新陳代謝等［3］。

很多研究表明，鈣 (Ca)在植物抗逆境過程中具有重要作用，外源Ca可增強植物對許多非生物逆境的適應性，減輕逆境對植物所造成的傷害［4－5］，營養(yǎng)液及土壤中添加Ca對Cd的毒害具有緩解作用［6］。

生菜 (Lactuca sativa)別名萵苣，屬菊科萵苣屬植物，生菜營養(yǎng)價值較高，主要以生食為主，是涼拌色拉、漢堡包不可缺少的蔬菜。在南方普遍栽培，是人們喜食的葉菜類之一。因生菜多在城市郊區(qū)種植，易受Cd污染。因此，研究生菜Cd積累及毒害生理機制，培育食用部位含Cd量低的生菜品種具有重要的理論和實際意義。

本試驗以生菜為材料，研究Ca對不同 Cd水平脅迫下的生菜植株生長生理的影響，探討Ca對不同Cd水平下生菜抗氧化酶活性的變化以及影響植株生長的生理機制，以求為發(fā)展綠色食品和無公害蔬菜提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和處理

試驗用生菜秧苗受贈于桂林市穿山鄉(xiāng)，品種為生菜王 (Lettuce)。

秧苗先用自來水沖洗根上的泥土，挑選生長一致的幼苗在營養(yǎng)液中進行預培養(yǎng)，每盆5株，營養(yǎng)液配方采用華南農(nóng)業(yè)大學葉菜類配方［7］，預培養(yǎng)1周后，進行脅迫處理。

試驗設置如下:1號不加 Cd對照 (CK);2號Ca 20 mg·L－1(以CaCl2加入，下同);3號Cd 10 mg·L－1(以 CdSO4加入，下同);4號 Cd 20 mg·L－1;5 號 Ca 20 mg·L－1+Cd 10 mg·L－1;6號 Ca 20 mg·L－1+Cd 20 mg·L－1。重復 3 次。分別于處理后10 d取樣測定過氧化物酶 (POD)、過氧化氫酶 (CAT)、超氧化物歧化酶 (SOD)的活性和丙二醛 (MDA)、還原性糖含量。第20天測定葉綠素含量和植株生長量。

1.2 測定方法

POD活性的測定:用愈傷木酚氧化法［8］，以470 nm波長下每1 min每1 g材料的光密度變化表示酶活性大小。

CAT活性的測定:用紫外吸收法測定［9］，以1 min內D240減少0.1為一個酶活性單位。

SOD活性的測定:按Giannopolitis和Ries的方法，以每單位時間內抑制光化還原50%的氮藍四唑 (NBT) 為一個酶活性單位［10］。

MDA含量的測定:采用硫代巴比妥酸比色法測定 MDA 含量［8］。

還原性糖含量的測定:用蒽酮法［8］。

葉綠素含量的測定:采用分光光度法，用Arnon 法計算葉綠素含量［8］。

生長量測定:采用尺寸測量法和天平法。

數(shù)據(jù)采用Excel軟件處理，采用 SPSS 13.0軟件用單因素方差分析對以上數(shù)據(jù)進行樣品的差異顯著性檢驗，采用LSD方法進行多重比較檢驗。

2 結果與分析

2.1 對生菜幼苗生長的影響

從表1可見，培養(yǎng)20 d時，2號處理株高和鮮重與對照基本相同，3號、4號處理則株高和鮮重均比對照低，且濃度愈高作用愈明顯，但5號和6號有Ca存在時，株高和鮮重則分別比3、4號高，說明Ca有緩解Cd毒害的作用。

2.2 對生菜幼苗葉綠素含量和組分的影響

葉綠素是植物進行光合作用的色素，其含量高低可以在一定程度上反映光合作用水平［11］。葉綠素含量降低，光合作用減弱，會導致植物生長受抑制，生物量下降。從表1可以看出，隨著Cd污染濃度的升高，葉綠素總量呈下降的趨勢，同時葉綠素a/b比值隨著Cd污染濃度的增高而降低，說明Cd毒害使生菜葉片葉綠素含量降低，且對葉綠素a的影響小于對葉綠素b的影響。從表1中還可以看出，Ca+Cd，處理幼苗葉綠素含量和組成均高于Cd處理，說明Ca有緩解Cd毒害，保持較高水平葉綠素含量的作用。

表1 各處理對生菜幼苗株高、鮮重和葉綠素的影響

2.3 對生菜幼苗抗氧化能力的影響

2.3.1 SOD活性

SOD是重要的活性氧清除酶，能保護細胞免受活性氧脅迫的傷害。圖1看出，Cd脅迫下SOD活性有所提高，Ca存在時SOD活性比單一Cd脅迫的酶活性高，這可能與植物在逆境時通過提高SOD活性起應激反應有關。說明Ca有提高生菜幼苗抗重金屬脅迫的能力。但隨著脅迫時間的延長，各處理的SOD活性均大幅度下降。

圖1 Ca對Cd脅迫下生菜幼苗SOD活性的影響

2.3.2 CAT活性

CAT也是清除H2O2重要的保護酶，圖2反映了Cd脅迫和Ca對生菜幼苗葉片CAT活性的影響。在處理的早期處理3～6生菜幼苗中的CAT活性均有明顯的增加，Ca處理從開始到結束，CAT活性均比CK組高，但是差異并不明顯。這說明Ca有提高CAT活性的能力，在處理后期，處理3～6幼苗中的CAT活性均下降。試驗結果與生菜SOD活性變化相似，這可能與植物在逆境時也通過提高CAT活性消除活性氧有關。

圖2 Ca對Cd脅迫下生菜幼苗CAT活性的影響

2.3.3 POD活性

POD是植物體內重要的抗氧化酶，能有效清除H2O2。圖3反映了鎘Cd脅迫時Ca對生菜幼苗葉片POD活性的影響。

從圖3可知，隨著處理時間的延長，處理3～6的POD活性從開始到實驗結束始終高于對照，處理5～6的POD活性一直比處理3～4的 POD活性高，反映Ca有提高POD活性的作用。

圖3 Ca對Cd脅迫下生菜幼苗POD活性的影響

2.3.4 MDA含量

植物在逆境環(huán)境中，細胞膜中的不飽和脂肪酸會發(fā)生過氧化作用產(chǎn)生MDA，使質膜系統(tǒng)受到傷害，其選擇性受到破壞，導致細胞內電解質外滲量增加，因而MDA含量可反映膜脂過氧化作用的強弱，質膜透性可表示膜傷害或變性的程度［12］。圖4反映了鎘脅迫下Ca對生菜幼苗葉片MDA含量變化的影響。在整個試驗中，處理3～6植株葉片MDA含量明顯比CK組多，達到了顯著水平 (P＜0.05)，特別是處理5～6始終比處理3～4的MDA含量要低，并且達到了顯著水平，這說明Ca離子在一定程度上增強了生菜抵抗重金屬的能力。

圖4 Ca對Cd脅迫下生菜幼苗MDA含量的影響

2.4 對生菜幼苗可溶性糖含量的影響

可溶性糖是參與細胞滲透調節(jié)的主要物質之一，糖的積累能提高細胞滲透濃度，在植物抗性的維持中具有重要作用。圖5反映了Ca對Cd脅迫下生菜幼苗可溶性糖含量的影響。從圖5中可知，Cd脅迫使生菜幼苗體內的可溶性糖含量下降，加Ca處理組生菜幼苗中的可溶性糖含量均比未加Ca處理組幼苗中可溶性糖含量高，差異明顯已達到顯著水平，反映Ca處理有緩解鎘毒害的作用。

圖5 Ca對Cd脅迫下生菜幼苗可溶性糖含量的影響

3 小結和討論

活性氧 (如·O2－，·OH，H2O2等)是植物正常代謝中的產(chǎn)物，在逆境脅迫下，活性氧代謝系統(tǒng)的平衡會受到影響，植物體內的活性氧大量生成?；钚匝醯纳吣軉幽ぶ^氧化或膜脂脫脂作用，從而破壞膜結構［8－9］。SOD和 CAT是存在于植物細胞中重要的清除自由基酶類之一，它的主要功能是清除超氧化物自由基·O2－和H2O［213］，其活性的大小與植物抗逆的能力相關［14］。試驗反映，在Cd脅迫的早期，加入Ca能提高SOD和CAT的活性，從而提高清除自由基的能力，緩解Cd脅迫對生菜幼苗的傷害;但是，隨著Cd脅迫時間的延長，Ca逐漸失去提高幼苗SOD、CAT活性的作用，這可能是加入Ca使SOD、CAT活性提高是有限度的，隨著脅迫的加重，保護機制可能被破壞，因此，隨著Cd脅迫時間的延長，SOD、CAT活性又發(fā)生了急劇下降。在本次試驗中 CAT、SOD兩者活性的影響具有相關性，兩者活性變化趨勢基本一致，這說明加Ca能夠通過提高抗氧化酶類活性從而提高對鎘的抗逆性。

POD是植物體內重要的代謝酶，也是植物體內的抗氧化酶之一，過氧化物酶活性的高低不僅反映植物生長發(fā)育及內在代謝情況，同時也是植物抗性好壞的標志之一［12，15］。從試驗可以看出 Cd脅迫時Ca對生菜幼苗葉片POD活性的變化與Cd脅迫時Ca對生菜幼苗葉片SOD、CAT活性的變化不一致，POD的活性是從試驗開始到試驗結束持續(xù)升高，表明其對Cd脅迫的適應性比較強，暗示POD活性在抗Cd脅迫的過程中起關鍵性的作用。

MDA是生物體代謝和生物膜系統(tǒng)脂質過氧化作用下的產(chǎn)物，MDA含量的多少反映了細胞膜脂過氧化的程度，是一種重要的逆境生理指標。本試驗說明生菜體內膜脂過氧化的程度受Cd處理濃度和處理時間的雙重影響，處理濃度越大、時間越長，生菜體內膜脂過氧化程度越大，植株受的傷害越大。Ca能維持細胞膜結構的穩(wěn)定，在逆境下具有保護植物細胞膜免遭損傷、降低離子滲漏的功能，原因可能是Ca與膜磷脂的極性頭部結合，通過交聯(lián)作用，使膜脂分子和蛋白質分子結合緊密，從而降低了膜的透性［15］。說明Ca減輕了鎘的生理毒害，可能與它維持細胞膜和細胞壁結構的完整性有關。

植物為了適應逆境條件，也會主動積累一些可溶性糖、脯氨酸等物質，以適應外界環(huán)境條件的變化?？扇苄蕴鞘菂⑴c細胞滲透調節(jié)的主要物質之一，糖的積累能提高細胞滲透濃度，增加抗性能力，在植物抗性的維持中具有重要作用。賀迪等［16］發(fā)現(xiàn)Zn2+脅迫下可溶性糖含量的增加有利于細胞或組織持水，防止脫水從而使得細胞內大分子糖類的分解加強而合成受抑，最終導致可溶性糖含量上升。本試驗也表明，外源Ca可以促進生菜體內可溶性糖含量增加，這可能與提高生菜抗重金屬鎘毒害的能力有關。

據(jù)報道，Cd脅迫下，植物葉綠體結構受損，葉綠素生物合成受阻［16］，導致葉綠素總量降低，植物光合作用受到抑制，從而引起植物長勢較弱，生長量減少。本試驗中，隨著Cd濃度的增加和時間的延長，生菜葉綠素含量明顯降低、植株矮小，這與王林在蘿卜上的研究結果相似［17］，導致了植物的光合能力降低，生長延緩。Ca處理葉綠素含量和組成均高于 Cd污染處理，這說明了Ca能增加生菜幼苗的抗Cd能力。

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