高曉林，李 瑛

（山西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院口腔科，山西太原 030001）

金屬蛋白酶組織抑制劑（tissue inhibitors of metalloproteinases，TIMPs）是天然的基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）抑制劑，存在于大多數(shù)組織和體液中。通過調(diào)節(jié)MMPs活性維持細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定及組織重建[1]。目前，TIMPs已發(fā)現(xiàn)有 4 種類型：TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3、TIMP-4[2]。 其中，TIMP-1一直是分子細(xì)胞生物學(xué)研究的重點(diǎn)，隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)TIMP-1是一種多功能蛋白，除了可以調(diào)節(jié)ECM代謝之外，TIMP-1還能調(diào)控細(xì)胞增殖分化、凋亡、遷徙、血管生成等，這些功能并非完全通過抑制MMP的途徑[3]。但TIMP-1對牙周膜成纖維細(xì)胞（periodontal ligament fibroblasts，PDLF）的生物學(xué)特性的影響報道較少。本實(shí)驗(yàn)的目的是觀察外源性TIMP-1對體外培養(yǎng)的PDLF的生長增殖和ALP活性表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

人重組金屬蛋白酶組織抑制劑-1（recombinant human TIMP-1，Peprotech，USA）；DMEM（culbecco's modified eagle media）培養(yǎng)液（Gibco，USA）；胎牛血清（FBS，杭州四季青生物工程材料有限公司）；堿性磷酸酶試劑盒（南京建成生物工程研究所）；25 ml塑料培養(yǎng)瓶、96 孔板（Orangescientific）；CO2培養(yǎng)箱（AshevilleNC，USA）；Unic7200分光光度計(jì)（上海尤尼柯儀器有限公司）。

1.2 人PDLF細(xì)胞體外培養(yǎng)

將儲存在液氮中的第3代PDLF取出后迅速置于37℃水浴箱中加熱，完全溶解后移入25 ml培養(yǎng)瓶中，加入5 ml含100 ml/L滅活FBS、100 mg/L鏈霉素、100 U/L青霉素的DMEM培養(yǎng)液，混勻后置37℃、50 ml/L CO2、950 ml/L空氣的標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下孵育，每3天換液1次，直至細(xì)胞長滿瓶底80%左右時，用0.25%胰蛋白酶消化法進(jìn)行傳代，取5～7代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 方法

1.3.1 接種細(xì)胞及分組 取第5代PDLF，用胰酶消化后制成細(xì)胞懸液，以2×105/ml的濃度接種于 96孔板內(nèi)，每孔 100 μl，置入37℃、5%CO2的無菌孵箱中培養(yǎng)24 h后，棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，PBS液洗2次，分為1個對照組和4個實(shí)驗(yàn)組，每組8孔。對照組加入10%FBS的DMEM培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組分別加入含系列濃度 TIMP-1（1 ng/ml、10 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml）的DMEM培養(yǎng)液，每孔 100 μl。 培養(yǎng) 24、48和 72 h，分別測定 MTT和ALP活性。

1.3.2 噻唑藍(lán)（MTT）檢測 培養(yǎng)不同時間后，每孔加入MTT液（5 mg/ml）20 μl，37℃培養(yǎng) 4 h，棄培養(yǎng)液，每孔加入二甲基亞砜（DMSO）100 μl，混勻，酶標(biāo)儀測 OD 值，波長 490 nm。

1.3.3 堿性磷酸酶（ALP）檢測 培養(yǎng)不同時間后，每孔取50 μl加入到測定管，再分別加入0.5 ml的緩沖液和基質(zhì)液；標(biāo)準(zhǔn)管中為50 μl的0.1 mg/ml酚標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液和分別加入的0.5 ml的緩沖液和基質(zhì)液；空白管中為50 μl的雙蒸水和分別加入的0.5 ml的緩沖液和基質(zhì)液，將其充分混勻，37℃水浴15 min。每管加入1.5 ml顯色劑，立即混勻，分光光度計(jì)比色，空白管調(diào)零，測各管吸光度，波長為520 nm。堿性磷酸酶（金氏單位/100 ml）=（測定管吸光度/標(biāo)準(zhǔn)管吸光度）×標(biāo)準(zhǔn)管含酚的量（0.005 mg）×（100 ml/0.005 ml）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，對各組8個標(biāo)本測定數(shù)值的均值進(jìn)行單因素方差分析，并比較各實(shí)驗(yàn)組與對照組之間的差異，顯著性水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 MTT檢測結(jié)果

與對照組比較，1 ng/ml的 TIMP-1在 24、48、72 h時對PDLC有顯著的促增殖作用（P＜0.05），10 ng/ml的 TIMP-1 在48、72 h對PDLC有顯著的促增殖作用（P＜0.05），而100 ng/ml的TIMP-1則對PDLC有抑制作用。

2.2 ALP檢測結(jié)果

與對照組相比，1 ng/ml的TIMP-1在24、48和72 h對PDLC有顯著增強(qiáng)ALP活性的作用（P＜0.05），10 ng/ml的TIMP-1在48 h對PDLC有顯著增強(qiáng)ALP活性的作用（P＜0.05），而50 ng/ml的 TIMP-1在 72 h時及 100 ng/ml TIMP-1在24、48和 72 h時對PDLC有抑制作用。

表1 TIMP-1對人牙周膜細(xì)胞的增殖和ALP活性的影響（，ng/ml）

表1 TIMP-1對人牙周膜細(xì)胞的增殖和ALP活性的影響（，ng/ml）

與對照組比較，*P＜0.05

檢測 時間TIMP-1實(shí)驗(yàn)組方法 （h） 對照組 110 50100 MTT240.282±0.0110.307±0.015*0.299±0.0180.280±0.0090.250±0.013*480.301±0.0220.344±0.023*0.348±0.027*0.326±0.0190.263±0.012*720.327±0.0320.390±0.035*0.387±0.015*0.366±0.0410.281±0.031*ALP242.857±0.2103.273±0.278*3.015±0.2272.554±0.2892.265±0.392*484.439±0.2565.043±0.298*4.949±0.310*4.275±0.3743.231±0.313*724.623±0.3745.271±0.373*4.850±0.4484.089±0.310*3.344±0.428*

3 討論

牙周病是引起牙周組織缺損最終導(dǎo)致牙齒缺失的常見病因。PDLF是牙周組織內(nèi)的主要細(xì)胞成分，在牙周組織再生與修復(fù)中發(fā)揮重要作用。其中多種生物活性因子構(gòu)成的因子網(wǎng)絡(luò)可影響其修復(fù)和再生，因此，充分開發(fā)和運(yùn)用生物活性因子，促進(jìn)牙周再生能力和潛力成為當(dāng)前研究領(lǐng)域的重點(diǎn)之一。PDLF與其他成纖維細(xì)胞不同，除具有形成及維持牙周膜的特殊功能外，還對鄰近的牙槽骨和牙骨質(zhì)具有修復(fù)、改建和再生的作用。

TIMP-1是一個包括184個氨基酸長度的單鏈多肽，它包含由12個半胱氨酸殘基形成的6個二硫鍵，將TIMP-1分子分隔為2個單獨(dú)的區(qū)域[4-5]。它是一個伴有糖基化和非糖基化形式的高糖基化分子，具有的表觀分子量分別為20.0和28.5 kDa。人類的TIMP-1基因位于X染色體，Xp11.1[5]。TIMP-1可由成纖維細(xì)胞、上皮和內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞表達(dá)，并可誘導(dǎo)包括角質(zhì)化細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、上皮和內(nèi)皮細(xì)胞等多種正常細(xì)胞的生長[1]。據(jù)報道，TIMP-1蛋白可在人牙齦成纖維細(xì)胞（Gin-1 cells）的胞核中積聚，在細(xì)胞周期的S期達(dá)到最大量[6]。

堿性磷酸酶是機(jī)體內(nèi)的一種重要的酶類，廣泛分布于體內(nèi)幾乎所有的器官。通過水解磷酸酯破壞礦化抑制物及通過作為鈣結(jié)合蛋白和磷酸基轉(zhuǎn)運(yùn)因子而促進(jìn)礦化，其活性可反映相應(yīng)細(xì)胞向成骨方向轉(zhuǎn)化的趨勢。因此，ALP活性已成為觀察牙周膜成纖維細(xì)胞分化功能的一項(xiàng)重要指標(biāo)[7]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TIMP-1可以促進(jìn)PDLF的增殖和分化，進(jìn)而促進(jìn)PDLF對牙根附著和向成骨細(xì)胞分化，使之有利于牙周組織修復(fù)和牙槽骨重建，這一研究也為牙周病的治療提供了重要的理論依據(jù)。

TIMP-1可通過酪氨酸磷酸化及之后的有絲分裂原激活蛋白激酶（MAPK）的活化，促進(jìn)人骨肉瘤細(xì)胞株的增殖[8]。Akahame等[9]研究表明，TIMP-1通過細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）和磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）信號途徑，促進(jìn)主動脈平滑肌細(xì)胞（AoSMC）細(xì)胞周期進(jìn)行。TIMP-1促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有待進(jìn)一步研究。

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