李 松，崔其亮

（1.廣東省東莞市石龍人民醫(yī)院，廣東東莞 523326；2.廣州醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院，廣東廣州 510000）

新生兒壞死性小腸結腸炎（neonatal necrotizing enterocolitis，NEC）是新生兒尤其是早產兒胃腸道的一種嚴重、需要急救治療的疾病，病死率為10%～50%[1]。NEC在發(fā)病過程中出現胃腸功能紊亂，引發(fā)水電解質代謝障礙是該病的重要表現之一。水通道蛋白（AQPs）是一組構成水通道與水通透性有關的細胞膜轉運蛋白，廣泛存在于動物、植物及生物界，它們的發(fā)現起始于Agre-P[2]。在消化道，AQPs在腸上皮細胞頂端質膜表達對水通透性起重要作用，并證實與多種疾病發(fā)病有關，但NEC發(fā)病過程中出現的水代謝障礙是否與AQPs表達變化有關，國內外相關報道較少。本文通過建立NEC鼠模，用熒光定量技術揭示NEC發(fā)病過程中出現的水代謝障礙與AQPs之間的關系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

封閉群新生1日齡SD大鼠，雌雄不限，體重8～10 g，由廣東省實驗動物中心提供。與母鼠同籠，母鼠喂養(yǎng)。母鼠自由飲水，喂以條桿狀動物飲料，室溫15～25℃，自然采光。

1.2 主要儀器及試劑

Mx-3000P熒光定量儀（美國Stratagene公司）；自制有機玻璃常壓低氧艙大小為5 L的廣口瓶，氣孔和出氣孔各1個；CY-7指針式測氧儀（成都貝斯達儀器有限公司）；總RNA提取試劑盒（美國Promega公司）；逆轉錄PCR試劑盒[Takara寶生物工程（大連）有限公司]；PCR反應試劑盒（SYBR GreenⅠ）[Takara寶生物工程（大連）有限公司]。

1.3 實驗方法及步驟

1.3.1 實驗動物及分組

1日齡SD大鼠共20只，體重8～10 g，分為實驗組（n=10）與對照組（n=10）。實驗組依照“1.3.2”項下方法暴露在低氧條件下，4 d后斷頭處死，對照組為空氣。

1.3.2 動物模型的制作[3]

先給低氧艙通入99.99%CO2，調節(jié)流速，應用CY-7指針式測氧儀，測得艙內的CO2濃度達99%后，放入1日齡新生SD大鼠5 min后取出，迅速向艙內通入99%O2，應用測氧儀使艙內氧濃度達99%，再將低氧后新生鼠放入艙內5 min取出。經處理后所有新生鼠均放回母鼠身邊喂養(yǎng)，至第4天斷頭處死，用眼科剪行剖腹術取出十二指腸下端至直腸上端的腸道組織，-70℃凍存。

1.3.3 染料法（SYBR GreenⅠ法）熒光定量PCR反應

1.3.3.1 鼠腸組織總RNA提取 總RNA提取試劑盒由Promega公司提供，按照操作說明上的SV Total RNA Isolation System步驟進行總RNA提取，并經瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性，紫外分光光度計測定A260和A280確定RNA質量。28s rRNA條帶強烈且A260/280位于1.8～2.0之間的RNA樣品用于后續(xù)實驗。

1.3.3.2 逆轉錄反應 逆轉錄反應使用Takara試劑盒進行，取總 RNA 4.0 μl，依次加入 5× Prime ScriptTMBuffer 2 μl，Prime ScriptTMRT Enzyme Mix 0.5 μl，Oligo dT Primer 0.5 μl，Random primers 0.5 μl， 加無 RNase 水補足配成總體積 10 μl的反應液，37℃ 15 min（逆轉錄反應），85℃ 5 s（逆轉錄酶的失活反應），合成好的cDNA放入-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3.3 引物的合成 熒光定量RT-PCR所用的AQP4、7、8和β-actin引物由Takara公司合成，PAGE純化級別。引物序列如下：β-actin，F 5'-GGA GAT TAC TGC CCT GGC TCC TA-3'，R 5'-GAC TCA TCG TAC TCC TGC TTG CTG-3'，第 1026～1175位核苷酸，片段長 150 bp；AQP4，F 5'-AGC CAC GGG CGT ATT CTG AG-3'，R 5'-CGC CTT GGT TCT GTA GGT TCT GA-3'，第 2615～2731 位核苷酸，片段長 117 bp；AQP7，F 5'-TTC CTG GCG GAG TTC CTG AG-3'，R 5'-TGC CAC ATG TAT TCC CAT GGT C-3'，第 322～468 位核苷酸，片段長147 bp；AQP8，F 5'-CGG TCA TCG AGA ACA GTC CAA ATA-3'，R 5'-GCG ACA CAG CAG GGT TGA AG-3'， 第292～417位核苷酸，片段長126 bp。

1.3.3.4 熒光定量PCR反應 以β-actin作為內參基因，采用SYBR GreenⅠ染料法進行PCR反應擴增，在測定目的基因的同時測定內參基因用以標準化標本。反應體系：RT反應液2 μl，加 SYBR Premix Ex TaqTM12.5 μl， 上下游引物各 0.5 μl，加dH2O補足至25 μl總體系。各取樣品3 μl，使用EASY Dilution按 10 倍梯度稀釋 4 次（1、1∶10、1∶100、1∶1000、1∶10000），每個濃度各取2 μl，行3個復孔進行PCR反應，制作標準曲線。由于采用相對定量法作比較，標準曲線的橫坐標并不要求真實的起始模板拷貝數，故制作標準曲線的時候需要設定模板的相對拷貝數。上述5個梯度的樣品對應設定的相對拷貝數分別為5×107copies/μl、5×106copies/μl、5×105copies/μl、5×104copies/μl、5×103copies/μl。 反應條件如下：95℃ 10 s 預變性，95℃ 5 s，60℃ 30 s，40個循環(huán)PCR反應。Mx-3000P熒光PCR儀自動讀出待檢樣品Ct值。另外以樣品中起始模板的拷貝數為橫坐標，Ct值為縱坐標，并以上述配制的按10倍梯度稀釋的樣品為5個點，繪制出標準曲線，自動計算出曲線的斜率（slope）及擴增效率（E）。

1.4 統計學處理

2 結果

對照組 AQP4、7、8 基因的平均 Ct值分別為（18.84±0.43）、（19.80±0.43）和（20.68±0.31）。 實驗組 AQP4、7、8 基因的平均Ct值分別為（21.85±0.45）、（22.62±0.24）和（23.51±0.20）。對照組 β-actin 基因的平均 Ct值為（15.40±0.31），實驗組 β-actin基因的平均 Ct值為（15.30±0.49）。

圖1～4中各條線分別表示 β-actin、AQP4、AQP7和 AQP8標準曲線，橫坐標代表相對模板濃度，縱坐標代表Ct值，5個梯度稀釋點基本在一條直線上，證明Ct值與相對拷貝數據呈良好的線性關系。熒光定量儀分析軟件求得標準曲線方程Y=aX＋b，X代表起始模板拷貝數，Y代表Ct值，這樣通過標準曲線中方程可求出待檢樣品的相對拷貝數。見表1。

圖1 β-actin標準曲線

圖2 AQP4標準曲線

圖3 AQP7標準曲線

圖4 AQP8標準曲線

表1 熒光定量RT-PCR測定各基因mRNA的相對表達量（）

表1 熒光定量RT-PCR測定各基因mRNA的相對表達量（）

用Pfaffl[4]推導的數學公式計算目的基因的相對表達量：

Ratio（R）表示目的基因在樣品與對照品間表達差異的倍數，分子部分為目的基因擴增效率，分母部分為內參基因的擴增效率?！鰿ttarget（control－sample）表示對照組與實驗組中目的基因的 Ct值之差，△Ctref（control－sample）表示對照組與實驗組中內參基因的Ct值之差。Etarget和Ereference分別表示目的基因和內參基因的擴增效率。如果目的基因與內參基因的擴增效率都接近100%且相差<5%，也可以將PCR擴增效率默認為100%，這樣公式就簡化為2-△△Ct，計算結果為R值。R<1表示基因表達下降，R>1表示基因表達上升。

采用Pfaffl等[5]設計的 REST-2005軟件運行 2-△△Ct公式，計算R值。把所有熒光定量資料包括各實驗組Ct值、對照組Ct值、模板Ct值和模板濃度倍數輸入計算機，運行軟件，軟件自動計算R值及P值。

根據REST-2005軟件計算結果，內參β-actin基因的R值為（1.000±1.079）。 AQP4、7、8 基因與內參 β-actin 基因比較，實驗組表達下降，R 值分別為（0.117±0.129）（P<0.05）、（0.140±0.156）（P<0.05）和（0.134±0.140）（P<0.05）。 實驗組 R<1，與對照組比較，有顯著性差異（P<0.05）。用REST-2005軟件計算各基因組QPCR反應的反應效率（E）、相對表達差異倍數（R）、樣本標準誤（SE）、95%可信區(qū)間（95%CI）及 P 值。結果見表2。

表2 各基因組QRT-PCR反應結果比較

3 討論

目前對AQPs的研究逐漸深入，發(fā)現AQPs參與多種消化道疾病的發(fā)病過程。主要集中在AQP1～8等幾種。研究發(fā)現，AQPs與口干癥[6]、便秘及大腸內液轉運有關[7]。Ma等[8]在AQP5的剔除實驗中發(fā)現，剔除AQP5基因的大鼠經毛果蕓香堿刺激后其唾液分泌量減少60%以上，而剔除AQP1基因及AQP4基因的大鼠唾液分泌量并未見明顯減少，說明AQP5在涎腺的分泌中扮演著關鍵的作用。血管活性腸肽（VIP）神經元廣泛分布于回結腸壁內，其遞質VIP抑制腸道蠕動，參與便秘的發(fā)生。AQPs是VIP作用的最終靶分子之一，VIP能過cAMP依賴的途徑上調AQP3及其mRNA的表達[9]，可以推測VIP參與便秘發(fā)生與上調AQPs的表達，從而促進水分的吸收有關。

小腸大部分切除后出現的腹瀉病，可能與AQPs上調有關。Tsujikawa等[10]研究SD大鼠小腸被大部分切除后AQPs mRNA在殘留小腸、回腸、結腸中表達的變化，他們選取6周齡SD大鼠（n=15），切除80%遠端小腸，殘留的小腸、回腸、結腸分別在術后第1、3、5、7天切開，提取殘留腸黏膜組織，用Northernblot技術分析AQPs mRNA的表達。結果發(fā)現，殘留小腸AQP1和AQP3 mRNA在術后1 d表達明顯增加，AQP7 mRNA在術后3 d增加，AQP4 mRNA術后無變化；結腸AQP3 mRNA在術后第1、7天表達增加，AQP4 mRNA無改變；AQP8 mRNA表達在術后第7天輕微增加，表明小腸大部分切除后除AQP4外，多種AQPs適應性上調。

Hardin等[11]用硫酸鈉葡聚糖（DSS）喂養(yǎng)小鼠制成結腸炎模型，在進食DSS后12 h～7 d，以及從停止進食DSS后的恢復階段第1天至第15天進行AQPs作用評價，并在實驗階段前3 d對鼠腸水分吸收進行測量。結果顯示，DSS組12～24 h后結腸AQP4、7、8表達開始減少并持續(xù)至第7天，停止進食DDS后逐漸恢復，且病變腸組織對水分的吸收減弱。從結腸炎、潰瘍性結腸炎及感染性結腸炎患者中提取的病理標本發(fā)現相似的改變。

新生兒時期嚴重的腸道疾病NEC雖然病因與成人結腸炎有很大不同，但從病理角度來看有非常相似的病理改變。各種原因引起的腸壁缺血、低氧被認為是發(fā)病的直接因素，特別在新生兒時期，窒息、低氧、休克等原因引起機體防御性反射，腸壁血流減少、缺血，腸黏膜屏障損傷情況容易發(fā)生。為了探討AQPs在其中所起到的病理作用，本研究制作鼠模型進行前期研究。

NEC鼠模是采用新生SD大鼠，模擬宮內低氧環(huán)境下制作而成，用高純度CO2在短時間內使鼠窒息，再通入高純度O2復蘇，造成腸道微循環(huán)缺血-再灌注損傷的病理過程。受損的腸組織通過熒光定量實驗證明，與空白組比較，AQP4、7、8 mRNA在NEC組表達下降，實驗僅說明AQPs在NEC鼠模中的表達改變，不能直接說明這些基因在發(fā)病中的調節(jié)機制。Laforenza等[12]認為APQs能起到使水跨細胞吸收或分泌的作用。腸功能出現障礙后，AQPs表達下降，可能與其蛋白質構象改變或發(fā)生移位有關。腸道的消化和吸收功能喪失，腸液大量排出，造成脫水腸液排進第三間隙及腹腔，造成體液丟失，引起內環(huán)境紊亂，AQPs的表達變化可能起到維持體液平衡及內環(huán)境穩(wěn)定的作用。

AQPs與NEC的發(fā)病關系主要涉及腸腔滲透壓的改變。NEC發(fā)病過程出現的水代謝障礙可能與AQPs的表達發(fā)生變化并引起腸腔滲透壓改變有關。由以上可知，水吸收的主要器官是消化道。AQPs表達的變化可以影響水的吸收，使機體出現水代謝障礙，本實驗NEC鼠模從外觀上分析有脫水的表現。NEC鼠模實驗證明AQPs表達下降，提示發(fā)生NEC病變時可引起細胞信號改變，導致AQPs合成障礙，從而形成NEC發(fā)病機制中的一個因素。目前AQPs在細胞內信號調節(jié)機制下出現的表達變化，在腎臟、肝臟已有很多學者闡述清楚，但在消化道方面仍然需要進一步研究。

AQPs參與消化道疾病是可能的，但發(fā)病機制較復雜。由于NEC是一種多因素引起的疾病，除AQPs外，還涉及其他如細胞因子、血管內皮素、血小板活性因子等參與發(fā)病過程。實驗的最終目的是揭示真相，為臨床打下基礎。希望通過本次實驗使相關工作者對AQPs給予足夠的重視，認識到AQPs受損是一個引起機體水代謝紊亂的危險因素。

本實驗建立鼠模采用熒光定量方法探討AQPs在消化道中的作用還有許多不完善的地方。首先，NEC是一種多因素引起的疾病，在該鼠模型不能完全反映出來；其次，對于AQPs與病因的聯系仍然認識不夠，不能認為AQPs受損直接導致NEC的發(fā)生。目前仍未發(fā)現AQPs與NEC發(fā)病的直接聯系。目前已有大量的前期工作從動物實驗、病理生理、分子生物學、基因表達等角度研究AQPs在機體內的表達及作用機制，這些基礎研究最終將應用到臨床，為解決疾病與健康問題提供理論依據。

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