趙海偉 鄒克琴 葉子弘 尤文雨

（中國(guó)計(jì)量學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310018）

茭白（Zizania latifolia（Griseb.））又名菰，是我國(guó)南方的一種水生蔬菜[1]。在太湖一帶的浙江和江蘇有大量栽種。在自然界中菰黑粉菌（Ustilago esculenta P.Hennings）屬于其內(nèi)生真菌，其與茭白共生，主要分布在茭白莖中[2]。菰黑粉菌生活在茭白莖中，抑制茭白開(kāi)花結(jié)實(shí)，刺激茭白莖部膨大，茭白膨大的莖部可供食用[3，4]。關(guān)于茭白孕茭的生理變化國(guó)內(nèi)有報(bào)道[5]，但是茭白和黑粉菌如何互作調(diào)節(jié)其莖部的發(fā)育的分子機(jī)制仍然不清楚。本文通過(guò)分離灰茭中的黑粉菌并進(jìn)行鑒定研究，為探索茭白莖發(fā)育的調(diào)控機(jī)制打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

“余茭4號(hào)”灰茭，于2007年11月采自浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院。

1.2 試劑

Taq酶，dNTP均購(gòu)自博日科技有限公司；pMD18-T Vector購(gòu)自大連寶生物公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒和大腸桿菌DH5α均購(gòu)自天根生化科技有限公司。

1.3 研究方法

1.3.1 菰黑粉菌的分離和培養(yǎng)

將“余茭4號(hào)”灰茭用流水沖洗，再用蒸餾水洗凈晾干，在超凈工作臺(tái)上用75%酒精擦拭表面，用無(wú)菌小刀橫向切開(kāi)，用接種環(huán)挑取黑色的孢子于1mL無(wú)菌水中混勻，取50μL涂布于PDA固體培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)。

1.3.2 黑粉菌的鑒定

1.3.2.1 形態(tài)鑒定

待PDA固體培養(yǎng)基中長(zhǎng)出單菌落后，肉眼觀察菌落形態(tài)，同時(shí)用牙簽沾取單菌落置于無(wú)菌水中，取10μL菌液顯微鏡下觀察。

1.3.2.2 菰黑粉菌的分子鑒定

(1)黑粉菌總DNA的提取

挑取單菌落接種于PDA液體培養(yǎng)基中，在搖床中以130r/min，28℃恒溫震蕩培養(yǎng)。第7天取培養(yǎng)液20mL，8000r/min室溫離心2mins，取菌體，參照吳志紅等[6]方法提取菌株基因組DNA。

(2)ITS-5.8S rDNA-序列的PCR擴(kuò)增

應(yīng)用真菌通用引物ITS1和ITS4擴(kuò)增其ITS5.8S rDNA。上游引物ITS1序列為：TCC GTA GGT GAA CCT GCG G，下游引物ITS4序列為：TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC，引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為：10×PCR Buffer 5μL，dNTPs Mixtur 4μL，Primer ITS1 1 μL，Primer ITS4 1 μl，DNA template 1μL，Taq 酶 1μL，加 ddH2O到50μL。PCR 反應(yīng)條件為 94℃ 5 min，94℃30s，50℃ 30s，72℃ 1min，30 個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10min。

(3)瓊脂糖凝膠電泳

取3μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠孔內(nèi)進(jìn)行電泳,用凝膠成像分析系統(tǒng)觀察并照相。

(4)克隆測(cè)序及序列分析 用DNA回收試劑盒回收純化目的DNA。將目的基因與pMD18-T載體連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌DH5α，在37℃培養(yǎng)12-14h后，用藍(lán)白斑篩選的方法,挑取白色單菌落,PCR鑒定該單菌落確實(shí)含有目的基因后,將菌液送至上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中BLAST，并進(jìn)行同源性比較。

2 結(jié)果

2.1 菰黑粉菌菌體形態(tài)觀察

在PDA固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天后，菌株形成單菌落，背面和正面均為白色，大小1-3 mm，。培養(yǎng)7-10后，單菌落逐漸變大，形狀為不規(guī)則圓形，波狀，中間隆起或有脊?fàn)钔黄?，單菌落顏色由白色逐漸變黃，且隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而加深（圖1）。

圖1 黑粉菌在平板上的形態(tài)

圖2 菰黑粉菌ITS-5.8SrRNA序列擴(kuò)增圖

M:DNA marker(從上到下大小：2000bp,1000bp,700bp,500bp,200bp,100bp)Lane1-2:菰黑粉菌PCR

2.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果

取3μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠孔內(nèi)進(jìn)行電泳。擴(kuò)增片段大小為775bp，結(jié)果見(jiàn)圖2。

2.3 黑粉菌5.8SrRNA的分子進(jìn)化樹(shù)分析

“余茭4號(hào)”灰茭黑粉菌ITS-5.8SrRNA序列經(jīng)測(cè)定后提交至GenBank，登錄號(hào)為FJ527029。根據(jù)ITS-5.8SrRNA序列，構(gòu)建菰黑粉菌（FJ527029）和黑粉菌屬其他31個(gè)不同種發(fā)育樹(shù)，見(jiàn)圖3。從發(fā)育樹(shù)上可以看到有5個(gè)明顯的類(lèi)群（圖中豎線(xiàn)），而分離出的黑粉菌（Ustilago esculenta）是黑粉菌屬的邊緣物種。

圖3 ITS5.8SrRNA序列的黑粉菌屬發(fā)育樹(shù)

3 討論

真菌的鑒定主要從真菌的孢子形態(tài)、菌落特征、生理生化特征等方面進(jìn)行。按照這種傳統(tǒng)的方法鑒定真菌需要較長(zhǎng)的時(shí)間和繁瑣的生化鑒定過(guò)程。隨著分子生物學(xué)鑒定手段運(yùn)用到真菌的分類(lèi)鑒定中，真菌5.8S rDNAITS區(qū)域是一段穩(wěn)定、保守而又具有種間特異性的基因區(qū)域，可以針對(duì)該區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行真菌的分子鑒定。本研究結(jié)合菌落形態(tài)和分子生物學(xué)手段對(duì)菰黑粉菌進(jìn)行了成功鑒定。采用真菌通用引物ITS1和ITS4成功擴(kuò)增了菰黑粉菌的ITS-5.8S rDNA區(qū)段，所測(cè)序列與NBCI上公布的菰黑粉菌同源性達(dá)到100%。

[1].陳守良,徐克學(xué).菰屬 Zizania L.植物的分支分類(lèi)研究[J].植物研究,1994,14(4）:385-394.

[2].柯衛(wèi)東，孔慶東.茭白肉質(zhì)莖形成的初步研究[J].長(zhǎng)江蔬菜，1996，（12）：23.

[3].Chan,Y.S.and Thrower,L.B.,The host parasite relationship between Zizania caduciflora Turcz.and Ustilago esculenta P[J].Henn New Phytol,1980,85:201-233.

[4].韓秀芹.茭白黑粉菌生物學(xué)特性的研究[M].2004,揚(yáng)州大學(xué)碩士學(xué)位論文.

[5].張聶，壽森炎.茭白孕茭的生理變化研究[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué),2006,6:613-617.

[6].吳志紅,汪天虹,黃衛(wèi).簡(jiǎn)便易行的絲狀真菌染色體DNA提取法[J].菌物系統(tǒng)；2001,11(2):38-39