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        丙泊酚對大鼠海馬CA1區(qū)突觸傳遞長時程抑制的作用

        2010-07-26 06:54:22李曉強孫雪華
        實用醫(yī)藥雜志 2010年1期
        關鍵詞:腦片基線丙泊酚

        李曉強,孫雪華

        丙泊酚是臨床常用的靜脈麻醉藥,主要通過易化或直接激活γ-氨基丁酸A型受體(GABAA)發(fā)生作用。臨床研究表明,丙泊酚麻醉后患者會有幾個小時的順行性遺忘、記憶障礙等認知功能缺陷[1],表明丙泊酚影響了學習和記憶。突觸傳遞的長時程增強 (long-term potentiation,LTP) 和長時程抑制(long-term depression,LTD)是在突觸水平研究學習和記憶的細胞模型,因此為了深入探討丙泊酚對認知功能的影響,筆者利用全細胞膜片鉗技術研究丙泊酚對大鼠海馬CA1區(qū)LTD誘導的影響,以期為臨床應用提供依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 動物 清潔級健康雄性Wistar大鼠(3周齡,由昆明人民醫(yī)院動物房提供)。

        1.2 主要試劑及儀器 丙泊酚購買于四川蜀樂藥業(yè)股份有限公司(批號 0405027,200 mg/20 ml),AP-5和Picrotoxin(pic)購買于Sigma公司。所有藥物都經(jīng)循環(huán)液給予。

        1.2.1 腦片制備 實驗遵循中科院昆明動物研究所的規(guī)定,并取得其同意。取雄性Wistar大鼠,快速斷頭,迅速取出腦置于氧(95%O2~5%CO2)飽和的冰水人工腦脊液中,其成分為(in mM)120 NaCl,2.5 KCl、1.25 NaH2PO4(·2 H2O)、26 NaHCO3、2.0 MgSO4、10 D-glucose、1.19 CaCl2(·2 H2O),氧飽和后,pH7.4。用振動切片機冠狀面切腦片,厚度為400 μm。將腦片放在孵育槽中浸在液面下的尼龍網(wǎng)上,不斷充以混合氣,并置于37℃恒溫水育槽中孵育 1h,然后置于室溫中(22~25 °C),0.5 h 后開始實驗。

        54張腦片隨機分為9組(每組6張),分別為10、30、50、100 μmol/L 丙泊酚組,100 μmol/L 丙泊酚+100 μmol/L pic組,LTD對照組,LTD丙泊酚組,LTD AP-5對照組,AP-5+丙泊酚組。

        1.2.2 膜片鉗記錄 將腦片移入傳統(tǒng)的記錄槽中,用兩片尼龍網(wǎng)將其固定在中間,置于直立的Nikon顯微鏡(10×10)下,以 3~4 ml/min的速度持續(xù)灌流氧飽和的人工腦脊液。鏡下確定海馬的CA1區(qū),將刺激電極放在Schaffer纖維,然后以盲插的方式記錄CA1區(qū)錐體細胞的EPSC,將細胞鉗制在-70 mv,細胞電阻穩(wěn)定后才開始記錄。實驗過程中用一個5mv的電壓持續(xù)監(jiān)測細胞的輸入阻抗和串形電阻。串形電阻大小一般在10~30 MΩ,只有在基線記錄時EPSC的變化不超過平均值的20%,記錄全程中細胞的輸入阻抗(100~300 MΩ)相對穩(wěn)定,且EPSC的最大值不少于100 pA時,數(shù)據(jù)才可用于分析。所記錄到的EPSC是單突觸的,因為在不同的刺激強度下同一細胞的EPSC的潛伏期穩(wěn)定,通常為2~4 ms。

        刺激電極由兩股含90%鉑金和10%銥的金屬絲制成,外涂以太氟龍(Teflon),兩股互相纏繞,內(nèi)徑為50 μm,外徑為75 μm。記錄電極用硼硅酸鹽毛細玻璃管制成(內(nèi)徑0.84 mm,外徑1.5 mm,World Precision Instruments,Inc.USA),當充以電極內(nèi)液后其電阻為3~6 MΩ。電極內(nèi)液成分為(in mmol/L): 130 K-gluconate、10 KCl、10 EGTA、1 CaCl2(·2H2O)、6 NaCl、10 HEPES、3MgATP、0.5NaGTP、5 QX314,用KOH調(diào)pH7.2,滲透壓為321mOsm。電刺激(持續(xù)0.1 ms)頻率為0.05 Hz,取EPSC最大值的50%為準,記錄10 min基線。然后以低頻刺激(900 pulse,3 Hz)誘導LTD,刺激強度同基線記錄時。誘導時將膜電位去極化至-50 mv。

        應用 Axopatch 200B(Axon Instrument,USA)放大器記錄數(shù)據(jù),濾波為5 Hz,數(shù)字化為20 Hz。并將數(shù)據(jù)存儲于計算機。實驗結果以興奮性突觸后電流(EPSC)幅值的變化來分析。LTD的值以低頻后20~30 min為準,應用Axoscope和Clampfit及Origin等軟件來分析結果。

        2 結 果

        2.1 丙泊酚呈劑量依賴性地抑制興奮性突觸后電流 10 μmol/L和30 μmol/L的丙泊酚對EPSC無明顯影響,而50 μmol/L和100 μmol/L的丙泊酚則可明顯抑制EPSC(表1),與基線相比,差異顯著(P<0.05)。為驗證丙泊酚的作用位點,在循環(huán)液中加入100 μmol/L Picrotoxin(一種GABAA受體阻斷藥),將腦片孵育0.5 h后,再觀察100 μmol/L的丙泊酚的作用,發(fā)現(xiàn)丙泊酚對EPSC的抑制作用完全被阻斷,而Picrotoxin本身對EPSC的基線無影響。

        表1 不同劑量組丙泊酚大鼠的EPSC(±s)

        表1 不同劑量組丙泊酚大鼠的EPSC(±s)

        與基線比較,*P<0.05

        組別 基線 加藥后10 μM PRO 0.999 7±0.05 1.091 1±0.07 30 μM PRO 1.000 3±0.05 1.001 7±0.08 50 μM PRO 1.000 0±0.03 0.727 5±0.06*100 μM PRO 1.000 3±0.04 0.581 2±0.09*pic+PRO 1.026 3±0.06 1.123 6±0.09

        2.2 丙泊酚易化LTD的誘導 當給予低頻刺激(3 Hz,900 pulse)后,可誘導出確切的 LTD,與基線相比差異顯著(P<0.05)。取對基線無影響的最大丙泊酚劑量30 μmol/L,孵育腦片,0.5 h后觀察LTD的誘導,發(fā)現(xiàn)30 μmol/L的丙泊酚可誘導出更大的LTD,與對照組相比差異顯著(P<0.05,表 2)。

        2.3 AP-5可以阻斷LTD的誘導 循環(huán)液中加入50 μmol/L的AP-5,一種特異性的NMDA受體拮抗劑,孵育腦片0.5 h,然后觀察對照組和丙泊酚組LTD的誘導,結果對照組和丙泊酚組LTD的誘導均被完全阻斷(表2)。

        表2 丙泊酚對LTD的誘導作用(±s)

        表2 丙泊酚對LTD的誘導作用(±s)

        與基線比較,*P<0.05;與對照組相比,#P<0.05

        組別 基線 低頻后25 min對照組 0.988 2±0.05 0.751 4±0.08*30 μM 丙泊酚組 0.991 1±0.04 0.544 0±0.04*#AP-5 對照組 1.017 6±0.02 1.078 3±0.07#AP-5+丙泊酚組 1.004 6±0.05 0.989 4±0.04#

        3 討 論

        γ-氨基丁酸(GABA)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要的抑制性神經(jīng)遞質。在成熟神經(jīng)元,GABA與其A型受體(GABAA受體)結合后,開放氯離子通道,使氯離子內(nèi)流,細胞內(nèi)超極化,從而產(chǎn)生中樞抑制作用。GABAA受體主要存在于中樞的抑制性中間神經(jīng)元上,而這種中間神經(jīng)元在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)分布廣泛。海馬的Schaffer-CA1突觸傳遞通路是單突觸谷氨酸能神經(jīng)傳導通路,能夠被抑制性中間神經(jīng)元折返抑制。丙泊酚的麻醉作用位點主要是中樞的GABAA受體[2]。丙泊酚主要是通過突觸前的GABAA受體或離子通道抑制谷氨酸的釋放而影響中樞興奮性。

        筆者采用膜片鉗技術,在大鼠海馬CA1區(qū)錐體細胞上記錄電刺激Schaffer纖維激發(fā)的EPSC,從細胞水平上研究丙泊酚對突觸傳遞的影響。本文結果顯示,在3周齡大鼠,10 μmol/L的丙泊酚對EPSC有輕微的興奮作用,但更低劑量的丙泊酚對EPSC沒有影響(結果未顯示)。這一現(xiàn)象發(fā)生的機制目前尚不清楚,可能要歸功于神經(jīng)系統(tǒng)的自穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié),因其不是筆者研究的重點,故未進行深入研究,但臨床研究表明丙泊酚要發(fā)揮其麻醉作用,血藥濃度必須達到一定的閾值(1.7~1.8 μg/ml),而其 50%有效濃度為 3.0~3.7 μg/ml[3]。隨著劑量的增大,丙泊酚逐漸顯現(xiàn)出對EPSC的劑量依賴性抑制作用。用Picrotoxin孵育腦片后丙泊酚的作用完全被拮抗,說明其作用是通過GABA受體發(fā)生的。雖然有研究表明,大劑量的丙泊酚可以直接抑制興奮性谷氨酸受體,如AMPA、NMDA受體[4],但筆者在實驗中未發(fā)現(xiàn)此種作用,因為Picrotoxin可完全拮抗丙泊酚的抑制作用,這也可能與筆者研究的選材有關系。前人的實驗是在單細胞上進行的,反映的是單一的受體和通道,而筆者實驗是在海馬腦片上進行的,反映的是整體水平的突觸效應。在臨床麻醉中,丙泊酚的血清有效濃度為8~180 μmol/L[5]。本文實驗中丙泊酚的50%有效量在100 μmol/L左右,與臨床麻醉相符。

        LTD是持久的、活動依賴性的突觸傳遞效能的降低,是記憶貯存機制LTP的補充,是學習與記憶的理論基礎之一。丙泊酚可以削弱大鼠海馬CA1區(qū)LTP的誘導[6],但對LTD的影響尚不清楚。

        本文實驗結果表明,在大鼠海馬CA1區(qū)全細胞記錄中對照組低頻可誘導出確切的LTD,而在丙泊酚組,LTD的表達增強,組間比較差異顯著,這與以往的活體實驗結果一致。丙泊酚易化LTD的誘導作用可被NMDA受體拮抗劑AP-5阻斷,說明這種LTD是NMDA受體依賴性的,而NMDA受體依賴性正是經(jīng)典突觸可塑性的特點之一。丙泊酚易化LTD誘導的機制,可能是丙泊酚激活GABAA受體,增強了中樞抑制,同時反復的刺激傳入(低頻)可誘發(fā)循環(huán)性抑制。而GABA受體拮抗劑Picrotoxin可抑制LTD的誘導而不影響LTD的維持,也說明LTD的易化是由于中樞抑制作用的增強。

        動物實驗表明,在嚙齒類動物給予鎮(zhèn)靜劑量的丙泊酚只產(chǎn)生順行性遺忘,遺忘程度隨劑量的增加而增強,這有助于消除手術中的不良記憶。當丙泊酚劑量增加到一定程度時[7],則可明顯影響動物的學習和記憶過程,小鼠訓練后30 min給予丙泊酚,則小鼠剛建立的被動逃避的條件反射難以長期保持,即發(fā)生了逆行性遺忘。這說明訓練后產(chǎn)生的瞬間記憶痕不牢固,易發(fā)生變化,隨著時間的延長而發(fā)生了遺忘。逆行性遺忘僅發(fā)生在訓練后3 h內(nèi)給予麻醉藥物,3 h后注射藥物則記憶不受影響。這表明小鼠學習訓練3 h后進行麻醉,訓練所獲得的條件反射的短期記憶可進入長期記憶階段。因此推測丙泊酚可能影響短期記憶至長期記憶的存儲過程。這種作用可能與激活GABA能神經(jīng)系統(tǒng)的功能密切相關,因為GABAA受體對記憶鞏固過程有下調(diào)作用[8]。

        有臨床研究報道,丙泊酚麻醉的患者,術后常有不同程度認知功能障礙等表現(xiàn),如順行及逆行遺忘等[9],而且蘇醒后數(shù)小時內(nèi)難于完成諸如駕車等精細工作,在兒科麻醉和鎮(zhèn)靜中也發(fā)現(xiàn)丙泊酚可影響患者的認知功能,這些都說明了丙泊酚麻醉可能影響了患者的記憶功能。經(jīng)丙泊酚麻醉的患者術中知曉的發(fā)生率較低,系因為其可產(chǎn)生順行性遺忘及逆行性遺忘,有利于消除術中的惡性記憶。

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