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        毛細(xì)管電泳/柱端安培檢測血清中谷氨酰胺

        2010-07-26 06:54:22劉大星王修德劉延秋
        實(shí)用醫(yī)藥雜志 2010年1期
        關(guān)鍵詞:血清檢測

        劉大星,王修德,劉延秋

        谷氨酰胺(glutamine,Gln)是一種具有特殊營養(yǎng)作用的“條件必需氨基酸”[1],作為體內(nèi)含量最豐富的氨基酸,體內(nèi)谷氨酰胺代謝的恒定對(duì)許多疾病的發(fā)生與發(fā)展有密切聯(lián)系[2]??焖俣行У販y定血中的谷氨酰胺對(duì)于谷氨酰胺代謝有關(guān)疾病以及臨床腸內(nèi)外營養(yǎng)研究等方面具有重要意義。目前測定谷氨酰胺常用的方法有液相色譜法[3,4]、氨基酸自動(dòng)分析儀法、紙層析法[5]、毛細(xì)管電泳法[6~8]等。 其中毛細(xì)管電泳技術(shù)以其高效、快速、靈敏、低耗等優(yōu)點(diǎn)在氨基酸分析中得到快速發(fā)展。但目前國內(nèi)外毛細(xì)管電泳技術(shù)測定谷氨酰胺的檢測法多采用紫外吸收法[8]和激光誘導(dǎo)熒光法[7],這些檢測法存在靈敏度低或儀器昂貴等缺點(diǎn)。而電化學(xué)檢測法與上述兩種檢測法相比,具有質(zhì)量檢出限低、線性范圍寬、選擇性好、設(shè)備簡單、價(jià)格低廉、高效快速等優(yōu)點(diǎn)[9]。本文采用毛細(xì)管電泳/柱端安培檢測系統(tǒng),選用萘二羧基醛(DNA)作為柱前衍生劑,研究了谷氨酰胺分離與檢測情況,確定了最佳實(shí)驗(yàn)條件,并進(jìn)行了人血清中谷氨酰胺分離檢測。

        1 材料與方法

        1.1 儀器與試劑 83-2.5型自動(dòng)新伏安儀(閩東分析儀器廠);3086型X-Y記錄儀(四川儀表四廠);高壓電源及JF-01型微電流伏安儀(山東省化工研究院與山東大學(xué)聯(lián)合研制);碳纖維(山東大學(xué)碳纖維研究中心)。碳纖維工作電極(制作方法同文獻(xiàn)[10])。 彈性石英毛細(xì)管(30 μm i.d.,360 μm o.d.;J&W Scientific incorporated,USA)。L-谷氨酰胺(第二軍醫(yī)大學(xué)政翔科技實(shí)業(yè)服務(wù)部化學(xué)試劑研究室,層析純),NDA(Fluka公司,純度≥99%),其它試劑均為分析純,實(shí)驗(yàn)用水均為亞沸蒸餾水。

        1.2 實(shí)驗(yàn)方法

        1.2.1 循環(huán)伏安法 在微型電解池中移入1 ml緩沖液,將柱狀碳纖維束工作電極插入溶液中,接通電解池,記錄底液的伏安曲線,加入待測試劑,混勻后記錄樣品的循環(huán)伏安曲線。

        1.2.2 毛細(xì)管區(qū)帶電泳/柱端安培檢測 選好一根長度合適的毛細(xì)管,高壓電源正極與毛細(xì)管進(jìn)樣端插入同一緩沖液池中,負(fù)極與毛細(xì)管出口端的緩沖液池連通,與充滿電泳緩沖液的毛細(xì)管構(gòu)成回路,形成毛細(xì)管區(qū)帶電泳分離系統(tǒng)。調(diào)節(jié)三維工作臺(tái)上的操作器,在顯微鏡下把工作電極對(duì)準(zhǔn)毛細(xì)管的出口。為避免外界干擾,毛細(xì)管出口端的三電極檢測系統(tǒng)放入屏蔽盒內(nèi),屏蔽盒接地。高壓電源負(fù)極與伏安分析儀的輔助電極相連并接地。向檢測池中注入電泳緩沖液,導(dǎo)通高壓回路與檢測系統(tǒng),選擇好合適的工作電勢,加高壓,20 min后毛細(xì)管中電流趨于穩(wěn)定,開始電滲進(jìn)樣,電泳分離檢測。柱端安培檢測器構(gòu)造同文獻(xiàn)[11],本實(shí)驗(yàn)中所有電勢值均相對(duì)于飽和甘汞電極。

        2 結(jié)果與討論

        2.1 谷氨酰胺與NDA在CN-存在下衍生產(chǎn)物的伏安特性 在室溫下,在pH=9.7的Na2B4O7-NaOH緩沖液中,在2.70×10-3mol/L CN-存在下,9.00×10-4mol/L谷氨酰胺與2.70×10-3mol/L NDA的衍生化反應(yīng)產(chǎn)物在碳纖維電極上有良好、穩(wěn)定的氧化響應(yīng),峰電勢約為0.63 V。衍生化反應(yīng)時(shí)間在0.5~8h所得的循環(huán)伏安圖的峰電流值最大且不變;在不同pH的緩沖液中谷氨酰胺進(jìn)行衍生化反應(yīng),在pH=9.7時(shí)衍生物有一最大峰電流。因此選擇柱前谷氨酰胺與NDA和CN-衍生化反應(yīng)的條件是:pH=9.7的Na2B4O7-NaOH緩沖液,反應(yīng)時(shí)間為30min。

        2.2 毛細(xì)管區(qū)帶電泳/柱端安培檢測谷氨酰胺最佳條件

        2.2.1 緩沖液的pH值 在pH=9.7左右,用Na2B4O7-NaOH緩沖體系選擇了5個(gè)pH值,研究谷氨酰胺衍生產(chǎn)物的毛細(xì)管區(qū)帶電泳/柱端安培檢測情況。隨pH增加,衍生反應(yīng)產(chǎn)物的遷移時(shí)間tm、柱效N隨pH增加而減小,而峰電流ip在pH=9.9時(shí)有一最大值。綜合考慮緩沖液pH對(duì)遷移時(shí)間tm、柱效N、峰電流ip的影響,本文選擇pH為9.7的Na2B4O7-NaOH緩沖液,此時(shí)峰電流ip值較大,柱效N值較高,遷移時(shí)間tm較短。

        2.2.2 分離電壓 隨分離電壓Vs的增大,遷移時(shí)間tm減小。當(dāng)Vs=20 kV時(shí),峰電流ip和柱效N均有最大值,故選擇分離電壓為20 kV。此時(shí)峰電流、柱效最大,遷移時(shí)間較短,基線平穩(wěn),峰形好。

        2.2.3 檢測電勢 在0.95~1.10 V隨檢測電勢Ed的增加,ip值迅速增大,當(dāng)檢測電勢超過1.10 V時(shí),峰電流ip值基本不再隨檢測電勢Ed的變化而變化。由于檢測電勢過高,基線噪音較大,應(yīng)盡量選擇較低的檢測電勢,故本文選擇的檢測電勢為1.10 V。此時(shí)檢測靈敏度高,測量重現(xiàn)性好,且基線噪音較小,峰形好。

        2.2.4 緩沖液濃度 隨緩沖液濃度的增加,谷氨酰胺衍生物的遷移時(shí)間tm延長,柱效N呈上升趨勢。峰電流ip開始隨緩沖液濃度的增加而加大,當(dāng)濃度達(dá)到 2.19×10-3mol/L Na2B4O7-9.39×10-4mol/L NaOH時(shí)峰電流ip值達(dá)到最大值后緩慢下降。無其它氨基酸干擾時(shí),選擇該濃度的緩沖液能得到低的檢測限。但血清中的酪氨酸(Tyr)干擾谷氨酰胺的測定,在此濃度的緩沖液中,谷氨酰胺與酪氨酸不能分開(圖1-1)。為提高柱效,增加了緩沖液的濃度, 在 2.00×10-2mol/L Na2B4O7-8.57×10-3mol/L NaOH緩沖液中,雖然谷氨酰胺的峰高有所降低,峰變寬,但卻可以使谷氨酰胺與酪氨酸很好地分離(圖1-2),分離度為2.0。所以在測定血清中谷氨酰胺時(shí),本研究選擇的緩沖液為:2.00×10-2mol/L Na2B4O7-8.57×10-3mol/L NaOH。

        圖1 谷氨酰胺、酪氨酸衍生產(chǎn)物電泳圖

        2.3 分析應(yīng)用

        2.3.1 重現(xiàn)性、檢測限和線性范圍 對(duì)5.00×10-5mol/L的谷氨酰胺衍生產(chǎn)物測定8次,遷移時(shí)間tm、峰電流ip的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.2%和3.1%。對(duì)1.00×10-6mol/L的谷氨酰胺衍生產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管區(qū)帶電泳/柱端安培檢測,得到高于基線3倍的響應(yīng)值,因此得到信噪比S/N=3時(shí)谷氨酰胺的濃度檢測限為1.0×10-6mol/L,質(zhì)量檢測限為1.08×10-15mol/L(1.08 fmol)。谷氨酰胺的線性范圍為 1.00×10-6mol/L~1.00×10-4mol/L,斜率為 1.1 pA/μmol·l,截距為0.27 pA,線性回歸系數(shù)為0.999 8。

        2.3.2 人血清中谷氨酰胺的測定 取人血清200 μl,加99%的乙醇600 μl,立即在旋渦振蕩器上充分混合振蕩,置4℃冰箱中10min后,1500×g離心15min除去血清中的蛋白,取上清液備用。取去除蛋白的血清 40 μl,分別加入緩沖液 900 μl,0.01 mol/L CN-30 μl和 0.01 mol/L NDA 30 μl, 反應(yīng) 30 min 后進(jìn)行毛細(xì)管區(qū)帶電泳/柱端安培檢測,得到人血清毛細(xì)管區(qū)帶電泳圖(圖2)。用標(biāo)準(zhǔn)加入法測得人血清中谷氨酰胺的含量為619 μmol/L?;厥章蕿?5%~103%。

        圖2 血清中谷氨酰胺毛細(xì)管電泳圖其余實(shí)驗(yàn)條件同圖1-2

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