張 云 孫嘉琳 王 雪 馮艷敏 李政楠 張洪娜

目前研究的金黃色葡萄球菌腸毒素A（即超抗原SEA）誘導的細胞毒性T細胞（CTL）對腫瘤細胞有強大的殺傷作用[1]。在臨床實踐中需要能對腫瘤細胞進行特異性殺傷的治療方法，而可選擇性地與腫瘤細胞結(jié)合的抗體的出現(xiàn)為腫瘤的生物治療提供了新的選擇[2]。SEA抗腫瘤細胞的體外實驗已經(jīng)有很多報道，并被證實存在一定的殺傷效果[3]，而小鼠體內(nèi)腫瘤模型的成功建立為SEA體內(nèi)殺傷腫瘤細胞的研究提供了便利的條件。本研究利用SEA對小鼠的腫瘤細胞進行治療，證實了SEA的體內(nèi)殺傷效果，并探討其殺傷腫瘤細胞的機制。

1 材料與方法

1.1 材料 Balb/c雄性小鼠40只，體質(zhì)量18～22 g，SPF級，購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心，許可證號 SCXK－（軍）－2002－001。隨機分成 4組，SEA 低劑量組（0．05 mg/kg），SEA 中劑量組（0.25 mg/kg），SEA 高劑量組（0.5 mg/kg）和生理鹽水對照組，每組10只，前3組為實驗組。S180細胞為天津科技大學食品學院饋贈。SEA為本實驗提取，生理鹽水注射液、干擾素（IFN）-γ鼠單克隆抗體購自南京金斯瑞生物科技有限公司，山羊抗小鼠SP檢測試劑盒購自上海西塘科技有限公司，DAB顯色試劑盒購自上海麥莎生物科技有限公司，蘇木素染色液購自北京賽馳生物科技有限公司，IFN-γ ELISA試劑盒購自北京四正柏生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠腫瘤模型的建立 取凍存復蘇的S180細胞株在5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，傳2～3代，取處于對數(shù)生長期的瘤細胞，用生理鹽水稀釋成1×107/mL的瘤細胞懸液,取其中0.2 mL對小鼠進行腹腔注射，10 d后，抽取小鼠腹水細胞。腹水細胞傳2～3代后，抽取離心，用生理鹽水洗2次，并稀釋成1×107/mL的瘤細胞懸液，以每只小鼠0.2 mL接種于小鼠右前腋皮下。接種24 h后開始給藥，實驗組每鼠腹腔注射0.2 mL相應(yīng)濃度的SEA，對照組注射等量生理鹽水，隔天給藥共4次。

1.2.2 腫瘤體積測量 接種后第5天，用游標卡尺開始測量腫瘤大小，連續(xù)測量5 d，并記錄下數(shù)據(jù)。

1.2.3 免疫組化法檢測組織中細胞因子IFN-γ的分布情況 給藥第8天，解剖小鼠并取下腫瘤組織，甲醛溶液固定，石蠟包埋，切5 μm厚的切片，組織脫蠟至水。在組織切片上滴加3%H2O2溶液，孵育15 min,以消除內(nèi)源性過氧化物酶的干擾;蒸餾水稍洗后，PBS洗5 min；滴加血清封閉液，孵育15min，甩去封閉液，滴加一抗，37℃孵育3 h，然后按二抗試劑盒說明書滴加各工作液，DAB顯色，稍洗后，蘇木精染色，自來水沖洗，鹽酸乙醇分化20 s。70%乙醇30 s→80%乙醇30 s→95%乙醇Ⅰ2 min→95%乙醇Ⅱ2 min→100%乙醇Ⅰ3 min→100%乙醇Ⅱ3 min→二甲苯Ⅰ透明7 min→二甲苯Ⅱ透明7 min→中性樹膠封片。顯微鏡觀察結(jié)果并拍照。

1.2.4 ELISA法測細胞因子IFN-γ指標 于末次給藥后24h，眼眶靜脈叢取血，每只小鼠取0.2 mL，離心，取上清，并取出腫瘤組織和脾臟，稱質(zhì)量，計算腫瘤抑制率和脾臟指數(shù)。腫瘤抑制率（%）＝（對照組腫瘤質(zhì)量－實驗組腫瘤質(zhì)量）/對照組腫瘤質(zhì)量；脾臟指數(shù)=脾臟質(zhì)量（mg）/小鼠體質(zhì)量（g）。用 PBS溶液溶解，采用酶標雙抗體夾心ELISA法測定血清、腫瘤和脾臟中IFN－γ的水平。按試劑盒說明書加標準品及上清液，加相應(yīng)的多克隆抗體，37℃孵育60 min，洗滌后加入辣根過氧化酶標記的抗體，再次孵育，洗滌后加顯色劑，終止反應(yīng)，492 nm波長處測吸光度，繪制標準曲線，計算出血清樣本IFN－γ含量。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，先進行正態(tài)性檢驗及方差齊性分析，多組間均數(shù)比較用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK法進行q檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Balb/c小鼠瘤體積及生長曲線 SEA組實體瘤體積均比生理鹽水對照組瘤體積增長緩慢，其中SEA高劑量組與對照組腫瘤體積相差最多，見圖1。

2.2 各組小鼠各項指標比較 見表1。與對照組比較，SEA中劑量組和SEA高劑量組腫瘤質(zhì)量下降，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。而SEA各組脾臟指數(shù)反而上升，除低、中劑量組外，各組比較差異有統(tǒng)計學意義，并且各組間隨著SEA劑量的增大，脾臟指數(shù)增加，腫瘤質(zhì)量減少。腫瘤組織中IFN-γ的分布情況見圖2。與對照組比較，SEA各劑量組血清中IFN-γ 均明顯增多，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜ 0．05）。并且SEA低劑量組分別與SEA中劑量和SEA高劑量比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)。SEA高劑量組的抑瘤率高于低、中劑量組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01），低、中劑量組差異無統(tǒng)計學意義。

表1 解剖后各組小鼠的各項指標比較（n＝10±s）

表1 解剖后各組小鼠的各項指標比較（n＝10±s）

觹P ＜ 0．05，觹觹P ＜ 0．01

組別對照組①SEA低劑量組②SEA中劑量組③SEA高劑量組④F q①∶②①∶③①∶④②∶③②∶④③∶④0.298 7.513**7.215**腫瘤質(zhì)量（g）0.816±0.030 0.797±0.017 0.784±0.021 0.457±0.022 561.303**2.610 4.396*49.313**1.786 46.703**44.918**脾臟指數(shù)（mg/g）10.317±0.742 16.310±2.854 23.270±1.895 27.517±2.562 35.906**5.074 10.968*14.564**5.893 9.489*3.596 IFN－γ（ng/L）28.431±12.167 34.423±7.828 49.402±3.810 58.674±7.723 37.915**3.918*13.715*19.778**9.797*15.860**8.725**抑瘤率（%）-2.33±1.95 3.92±2.12 44.00±3.21 931.740**---

3 討論

干擾素是由多種細胞產(chǎn)生的具有廣泛生物學活性的細胞因子家族,其功能主要包括抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、抑制細胞增殖、影響細胞分化、抑制血管生成等[4]。IFN-γ主要由活化T細胞產(chǎn)生，在小鼠，由Th1亞群產(chǎn)生。當抗原刺激后T細胞分泌IFN-γ，通常與IL-2的產(chǎn)生相一致。干擾素作為具有較強抗腫瘤活性和免疫調(diào)節(jié)作用的細胞因子[5],在腫瘤生物治療中占據(jù)了較為重要的位置。相信隨著對干擾素生理活性和作用機制的深入認識，可以進一步提高其臨床治療效果，在腫瘤治療領(lǐng)域也將具有更廣闊的應(yīng)用前景。

本實驗結(jié)果顯示，SEA組小鼠腫瘤生長速度明顯低于生理鹽水對照組，治療結(jié)束后SEA組腫瘤質(zhì)量及瘤體積明顯低于對照組，表明SEA可以抑制S180腫瘤細胞的生長。且腫瘤的生長情況與SEA的劑量有關(guān)，隨劑量的增大而呈下降趨勢，而實驗中，脾臟指數(shù)卻隨SEA劑量的增大呈現(xiàn)上升趨勢，說明SEA殺傷腫瘤的效果與T細胞的激活有關(guān)，從ELISA實驗中測得血清中IFN－γ的水平可以看出，腫瘤細胞死亡的原因在于T細胞分泌的細胞因子IFN－γ大量增多，說明超抗原SEA可刺激機體產(chǎn)生殺傷性很強的細胞毒T細胞（CTL）及大量的細胞因子，對腫瘤具有很強的殺傷作用。它們能與多數(shù)T細胞結(jié)合并為T細胞活化提供信號，而普通抗原只能與少數(shù)對應(yīng)T細胞結(jié)合并使之活化[6]。但是由于極微量的超抗原就可激活大量T細胞并大量分泌細胞因子，因此如果在應(yīng)用時劑量掌握不準，就有可能引起機體免疫調(diào)節(jié)功能紊亂而產(chǎn)生超敏反應(yīng)，導致一系列急慢性疾病的發(fā)生，如毒素中毒綜合征、風濕性關(guān)節(jié)炎、風濕熱、川崎病和非特異性皮炎等。超抗原殺傷腫瘤細胞的同時對正常細胞也有殺傷作用[7]。對SEA細胞靶向定位殺傷腫瘤細胞技術(shù)還有待進一步研究，進而降低SEA的不良反應(yīng)。

同時對于SEA是否能促進其他因子的分泌，分泌的IFN-γ等細胞因子通過哪條途徑作用于腫瘤細胞等還有待于深入研究，以利用其機制進一步提高其抗腫瘤潛能的途徑和方法；最后,通過基因重組的方法對干擾素蛋白進行改造[8]，可提高其生物學活性，并降低不良反應(yīng)。

[1] Liyanage UK,Moore TT,Joo HG,et al.Prevalence of regulatory T cells is increased in peripheral blood and tumormicroenvironment of patients with pancreas or breast adenocarcinoma [J].J Immunol,2002,169(5):2756-2761.

[2] Forsberg G,Ohlssonk Brodin T,et al.Therapy of human nonsmall-cell lung carcinoma using antibody targeting of a modified superantigen[J].Bri J Cancer,2001,85(1):129.

[3] 許桂蓮，朱錫華,楊勁，等.超抗原SEA誘導T細胞無能的作用機制探討[J].細胞與分子免疫學雜志,2002,18(6):105-107.

[4] Yu J,Tian R,Xiu B,et al.Antitumor activity of T cells generated from lymph nodes draining the SEA-expressing murine B16 melanoma and secondarily activated with dendritic cells[J].Int J Biol Sci,2009,5(2):135-146.

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[8] Zheng G,Chen A,Sterner RE,et al.Induction of antitumor immunity via intratumoral tetra-costimulator protein transfer[J].Cancer Res,2001,61（22）:8127-8134.