魯振宇 張?jiān)粕?糜若然

常規(guī)體外受精（IVF）或卵胞漿內(nèi)單精子注射（ICSI）發(fā)育形成的胚胎一般在體外培養(yǎng)2～3 d，于4～8個(gè)細(xì)胞期移植回子宮腔。然而，將胚胎培養(yǎng)至囊胚期移植更符合生理需要，是提高種植率、減少移植胚胎數(shù)目、避免多胎妊娠及減胎危險(xiǎn)的有力措施。胚胎的發(fā)育潛能直接影響著囊胚的形成以及形成囊胚的質(zhì)量。本研究主要應(yīng)用第3天胚胎移植后無凍存價(jià)值的廢棄胚胎進(jìn)行體外培養(yǎng)，分析不同細(xì)胞數(shù)量和質(zhì)量的胚胎對囊胚形成的影響，并且評價(jià)廢棄胚胎的囊胚形成對妊娠結(jié)局是否有一定的預(yù)測意義，為臨床實(shí)現(xiàn)囊胚期移植提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2006年12月—2009年5月在天津市中心婦產(chǎn)科醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心接受IVF-胚胎移植（ET）或ICSI-ET的196例不孕癥患者移植后剩余無凍存價(jià)值的406個(gè)廢棄胚胎，在患者簽署知情同意書后用于本研究。主要試劑：G1.3、囊胚培養(yǎng)液（CCM）、礦物油、HSA（Vitrolife公司）。

1.2 方法 胚胎培養(yǎng)至第3天，將移植后無凍存價(jià)值的廢棄的胚胎轉(zhuǎn)移到囊胚培養(yǎng)液CCM中序貫培養(yǎng)至第5～7天，觀察是否有囊胚形成，并對形成的囊胚按照Gardner[1]分級方法進(jìn)行分級。移植后28 d B超檢查發(fā)現(xiàn)妊娠囊視為臨床妊娠。分析比較第3天胚胎細(xì)胞數(shù)與囊胚形成之間的關(guān)系；第3天不同質(zhì)量胚胎的囊胚形成率、優(yōu)質(zhì)囊胚形成率有無差異；有囊胚形成的患者與無囊胚形成的患者妊娠率之間有無差異。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料用例（%）表示，行χ2檢驗(yàn)，相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)分析法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 囊胚形成情況 196例共406個(gè)廢棄胚胎中有64例共102個(gè)（25.12%）囊胚形成，其中優(yōu)質(zhì)囊胚28個(gè)，全部由Ⅱ+級以上胚胎形成。其中，細(xì)胞數(shù)＜4個(gè)的胚胎66個(gè)形成6個(gè)（9.09%）囊胚，細(xì)胞數(shù)4～5個(gè)的胚胎200個(gè)形成50個(gè)（25.00%）囊胚，細(xì)胞數(shù)6～11個(gè)的胚胎140個(gè)形成46個(gè)（32.86%）囊胚，第3天胚胎細(xì)胞數(shù)與囊胚形成率呈顯著正相關(guān)關(guān)系（r=0.99，P ＜ 0.01），Ⅰ～Ⅱ+級胚胎與Ⅲ～Ⅳ級胚胎囊胚形成率、優(yōu)質(zhì)囊胚形成率比較差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見表1。

表1 第3天不同質(zhì)量的胚胎對囊胚及優(yōu)質(zhì)囊胚形成的影響 例（%）

2.2 囊胚形成情況對妊娠情況的預(yù)測 64例有囊胚形成的患者有32例（50.00%）獲臨床妊娠，132例無囊胚形成的患者有38例（28.79%）獲得臨床妊娠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=10.43，P ＜ 0.05）。

3 討論

將胚胎序貫培養(yǎng)到囊胚階段進(jìn)一步提高了對胚胎發(fā)育潛能的篩選。囊胚階段移植，子宮內(nèi)膜與胚胎發(fā)育同步，有助于妊娠率的提高[2]。并且可使移植的胚胎數(shù)目減少，從而降低了多胎妊娠發(fā)生的可能。本研究應(yīng)用廢棄的胚胎進(jìn)行囊胚培養(yǎng)，培養(yǎng)方法簡單、可靠。

胚胎的質(zhì)量和囊胚的形成密切相關(guān)。Hardy等[3-4]研究表明，隨著胚胎碎片的增多，囊胚形成率降低，囊胚的細(xì)胞數(shù)目尤其是滋養(yǎng)外胚層數(shù)目減少。當(dāng)碎片>25%時(shí)，很少有胚胎能發(fā)育到囊胚階段[3]。碎片<10%時(shí)不會影響囊胚的形成，但是碎片>15%,囊胚的形成率顯著下降。碎片會影響細(xì)胞之間的連接，干擾細(xì)胞的融合、囊腔和囊胚的形成[4]；碎片釋放的有毒物質(zhì)會損傷其鄰近的細(xì)胞，使其凋亡；碎片還會減少胞質(zhì)的體積，耗竭胚胎發(fā)育所需要的細(xì)胞器[5]，造成卵裂球和（或）胞漿的損失。Neuber等[6]研究表明，第3天卵裂球數(shù)目≥7個(gè)的優(yōu)質(zhì)胚胎更容易發(fā)育成優(yōu)質(zhì)囊胚。囊胚形成率與卵裂速度成正比，卵裂速度較快的胚胎更容易形成優(yōu)質(zhì)囊胚[7]。本研究表明，第3天胚胎的細(xì)胞數(shù)與囊胚形成率呈正相關(guān)，第3天質(zhì)量好、碎片少的胚胎更容易形成囊胚和優(yōu)質(zhì)囊胚，第3天胚胎的形態(tài)可作為囊胚培養(yǎng)的指標(biāo)。雖然剩余質(zhì)量差的胚胎仍有機(jī)會發(fā)育成具有正常染色體的囊胚，但是其非整倍體概率大大增加，且種植率和妊娠率較低，經(jīng)患者簽署知情同意書后選擇丟棄或用于科學(xué)研究是正確可行的，特別是對來源非常有限的胚胎干細(xì)胞研究具有重要意義。

本研究發(fā)現(xiàn)，有囊胚形成的患者臨床妊娠率高于無囊胚形成患者，說明剩余胚胎的囊胚形成情況可以間接預(yù)測妊娠與否。大量的研究也表明，剩余胚胎形成囊胚對于妊娠的預(yù)測有積極的作用[8-9]。

人胚胎4~8個(gè)細(xì)胞期剛剛開始出現(xiàn)基因表達(dá)，8個(gè)細(xì)胞期以前的胚胎存在發(fā)育阻滯的現(xiàn)象，多數(shù)發(fā)育潛能差、染色體異常的胚胎不能發(fā)育到囊胚階段。因此，囊胚期胚胎具有更好的發(fā)育潛能。胚胎培養(yǎng)延長到囊胚期，使胚胎發(fā)育和子宮內(nèi)膜的生理階段同步化，宮頸黏液減少，利于移植操作，同時(shí)子宮壁收縮減弱，種植率提高。囊胚移植后著床率明顯提高，減少了胚胎的移植數(shù)目，甚至可實(shí)行單胚胎移植，從而降低多胎妊娠的風(fēng)險(xiǎn)，提高了IVF的治療效果。

[1] Gardner DK,Lane M,Stevens J,et al．Blastocyst score affects implantation and pregnancy outcome：towards a single blastocyst transfer[J]．Fertil Steril,2000,73(6)：1155-1158.

[2] Jeffrey DF，Herman R，Richard R，et al.The Graduated Embryo Score(GES)predicts blastocyst formation and pregnancy rate from cleavage-stage embryos[J].Hum Reprod,2001,16(9):1970-1975.

[3] Hardy K,Stark J,Winston RM.Maintenance of the inner cell mass in human blastocysts from fragmented embryos[J].Biol Reprod，2003,68（4）:1165-1169.

[4] Eftekhari-Yazdi P,Valojerdi MR,Ashtiani SK,et al.Effect of fragment removal on blastocyst formation and quality of human embryos[J].Reprod Biomed Online,2006，13(6):823-832.

[5] Antczak M,Van BJ.Temporal and spatial aspects of fragmentation in early human embryos:possible effects on developmental competence and association with the differential elimination of regμlatory proteinsfrompolarizeddomains[J].HumReprod,1999,14(2):429-447.

[6] Neuber E,Rinaudo P,Trimarchi JR,et al.Sequential assessment of individually cultured human embryos as an indicator of subsequent good quality blastocyst development[J].Hum Reprod,2003,18(6):1307-1312.

[7] Luna M,Copperman AB,Duke M,et al.Human blastocyst morphological quality is significantly improved in embryos classified as fast on day 3(>or=10 cells),bringing into question current embryological dogma[J].Fertil Steril,2008,89(2):358-363.

[8]Balaban B,Urman B,Sertac A,et al.Progression of excess embryo to the blastocyst stage predicts pregnancy and implantation rates after intracytoplasmic sperm injection[J].Hum Reprod,1998,13(9):2564-2567.

[9] Thomas MR,Sparks AE,Ryan GL,et al.Clinical predictors of human blastocyst formation and pregnancy after extended embryo culture and transfer[J].Fertil Steril,2009,29[Epub ahead of print].