王曉聞，章華平，陳 峰，王 茜，溫偉業(yè)

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 太谷 030801；2.克萊姆森大學(xué)食品與營養(yǎng)系，美國 南卡羅來納州 克萊姆森29634；3.克萊姆森大學(xué)遺傳與生物化學(xué)系，美國 南卡羅來納州 克萊姆森 29634；4.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西 太谷 030801)

絞股藍(lán)(Gynostemma pentaphyllum(Thunb.) Makino)又名七葉膽、公羅鍋底、落地生根、小苦藥、遍地生根、五葉參等，屬于葫蘆科(Cucurbitaceae)絞股藍(lán)屬(Gynostemma)，多年生草質(zhì)攀援藤本植物[1-2]，是一種傳統(tǒng)的中藥，在我國有悠久的應(yīng)用歷史。現(xiàn)代藥理學(xué)研究認(rèn)為絞股藍(lán)具有降低膽固醇水平、調(diào)節(jié)血壓、增強(qiáng)免疫能力、鎮(zhèn)靜、抗疲勞、抗?jié)兊茸饔肹3-5]。還有報(bào)道絞股藍(lán)的水煎溶液有抑菌作用[6]。在報(bào)道的絞股藍(lán)化學(xué)成分中主要是絞股藍(lán)皂甙，據(jù)Scifinder 數(shù)據(jù)庫資料顯示，截至2007年7月科學(xué)家已經(jīng)從絞股藍(lán)中分離出100多種絞股藍(lán)皂甙，但是未見有木脂素的報(bào)道。本研究在前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，對分離得到的3種木脂素抑菌作用進(jìn)行研究，為擴(kuò)展絞股藍(lán)的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

絞股藍(lán)由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物藥廠提供，由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院中獸醫(yī)教研室鑒定為絞股藍(lán)干燥全草，取根莖備用。

供試菌種：金黃色葡萄球菌(S ta ph y lo c co cu s aureus，C56024)、沙門氏菌(Salmonella enteritidis，ATCC 10708)、大腸桿菌(Escherichia coli，ATCC 4350)、變異鏈球菌(Streptococcus mutansClarke，ATCC 25175TM)購于美國ATCC公司。

柱層析硅膠(200～300目) 青島海洋化工有限公司；Sephadex LH-20凝膠、正反相薄層層析板德國Merk公司；AQ12S50-1000、ODS-AQ反相柱層析硅膠 日本YMC公司。

DPPH、BHT 美國 Sigma 公司；FeCl2、3-(2-吡啶基)-5,6-雙(4-苯磺酸)-1,2,4-三嗪(Ferrozine) 美國Fluka公司；EDTA、甲醇 美國Fisher公司。

Brucker AM-300核磁共振儀(1H (300 MHz)、13C(75 MHz)、四甲基硅(TMS)為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、CD3OD為樣品溶劑)；Q-TOF microTM質(zhì)譜儀 美國Waters 公司。

1.2 方法

1.2.1 絞股藍(lán)木脂素的提取分離純化

干燥的絞股藍(lán)根及莖5kg用95%乙醇于室溫下萃取3次(15L×3)，每次24h，合并萃取液，減壓濃縮干燥，得乙醇粗提物。將粗提物分散于適量水中，分別用氯仿萃取、棄氯仿層，再用乙酸乙酯反復(fù)萃取。收集乙酸乙酯層，減壓濃縮干燥后，硅膠柱層析進(jìn)行分離，用氯仿、甲醇混合液梯度洗脫，獲得一較純組分。獲得的組分進(jìn)行二次硅膠層析，正己烷和丙酮梯度洗脫，在正己烷與丙酮體積比為4:1處獲得化合物Ⅱ，并用甲苯和丙酮混合溶液溶解在室溫下緩慢揮發(fā)得到無色結(jié)晶；將正己烷和丙酮體積比為1:1處獲得的組分，用反相硅膠層析進(jìn)一步純化，洗脫液為甲醇和水，在甲醇和水體積比為3:7處獲得黃色粉末并用Sephadex LH-20進(jìn)行純化得到化合物Ⅰ，在甲醇和水體積比為1:1時(shí)獲得無色粉末為化合物Ⅲ。對3個(gè)純化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。

1.2.2 結(jié)構(gòu)鑒定

在美國Clemson大學(xué)化學(xué)系進(jìn)行并提供數(shù)據(jù)。

1.2.3 體外抗氧化能力測定

1.2.3.1 體外清除DPPH自由基清除能力的研究

DPPH自由基(1,1-苯基-2-苦肼自由基)清除能力方法參照Yamaguchi等[7]的報(bào)道略作改進(jìn)。將待測物用甲醇溶解，配成一定濃度，并作梯度稀釋。DPPH自由基濃度0.25mmol/L。在試管中分別加入0.5mL待測液和0.5mL DPPH自由基溶液，充分振搖后放于暗處在室溫下反應(yīng)30min然后于波長517nm處測定吸光度。用0.5mL待測液加等體積的甲醇作樣品對照，而0.5mL DPPH自由基溶液加等體積的甲醇作空白，測定時(shí)用純甲醇調(diào)零。按照公式(1)計(jì)算樣品對DPPH自由基的清除能力。以BHT作為標(biāo)準(zhǔn)對照。做3次重復(fù)取平均值。

1.2.3.2 體外螯合金屬的能力

此方法采用Dinis等[8]報(bào)道的方法進(jìn)行適當(dāng)改進(jìn)。將FeCl2和Ferrozine試劑分別配成2mmol/L和5mmol/L的溶液，樣品處理同1.2.1節(jié)。取600μL待測液與40μL FeCl2混合后加入80μL Ferrozine試劑溶液，充分混勻后在室溫下反應(yīng)10min后在波長562nm處測吸光度，同時(shí)做用等體積蒸餾水代替待測液做空白，等體積蒸餾水代替Ferrozine試劑做樣品空白。用EDTA反應(yīng)作標(biāo)準(zhǔn)，按公式(2)計(jì)算樣品的金屬螯合能力。

1.2.4 抑菌實(shí)驗(yàn)

取7支無菌試管分別加入1mL菌懸液，1號管中加入1mL質(zhì)量濃度為5mg/mL的化合物溶液，混勻，按照兩倍稀釋法依次稀釋至6號管，從6號管中吸取1mL混合液棄去，7號管做陽性對照，另取一管加滅菌水做陰性對照。這樣各試管中藥物質(zhì)量濃度分別為2.5、1.25、0.625、0.313、0.156、0.078mg/mL，將試管在37℃下培養(yǎng)18h后，從上述試管中各取0.5mL接種于制備好的瓊脂培養(yǎng)基上觀察菌落生長情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 絞股藍(lán)分離物結(jié)構(gòu)鑒定

得到的3個(gè)化合物中，化合物Ⅰ為一種新的化合物，命名為Ligballinone，化合物Ⅱ得到結(jié)晶并經(jīng)X衍射驗(yàn)證了其結(jié)構(gòu)[9]?；衔铫鬄闊o色粉末，分子式：C18H20O4，相對分子質(zhì)量300。碳譜及DEPT譜，碳譜上顯示有23個(gè)碳信號，13C DEPT顯示有4個(gè)CH2：δ65.43、δ62.54、δ36.13、δ32.81。7個(gè)CH：δ129.96、δ128.51、δ126.14、δ116.53、δ110.01、δ88.57、δ55.22。其結(jié)構(gòu)解析如圖1所示，核磁數(shù)據(jù)見表1。δ7.21 2H，d，J＝8.5在HMQC (1J coupling) 圖譜上對應(yīng)的碳δ128.51，其在DEPT上明顯是CH，峰強(qiáng)度明顯高于其他CH氫譜上積分為兩個(gè)氫，所以為兩個(gè)CH重疊。COSY (3J) 譜上顯示其與6.79 2H， d， J=8.5 耦合，而此二氫在HMQC上對應(yīng)的碳譜δ為116.53，DEPT顯示其為CH，其峰強(qiáng)度略高于其他CH，兩個(gè)CH重疊。所以其為標(biāo)準(zhǔn)的對位取代苯環(huán)。

由于δ6.79、7.21均為雙峰(耦合常數(shù)大于5Hz者認(rèn)為鄰位有質(zhì)子耦合)，二者鄰位必為季碳。

圖1 化合物Ⅲ結(jié)構(gòu)解析圖Fig.1 Structure elucidation of compound Ⅲ

表1 化合物Ⅲ的核磁數(shù)據(jù)Table1 1H, 13C NMR, DEPT and HMBC data of compound Ⅲ

向外面延伸，兩個(gè)苯環(huán)季環(huán)只可能有158.52及134.73兩個(gè)，如果鄰位有羥基會造成化學(xué)位移值下降，所以6.79、6.79間的季碳為連羥基季碳158.52，那另一個(gè)季碳就是134.73。同時(shí)HMBC還有信號，7.21與88.57碳相關(guān)，88.57只有與134.73相連?；衔铫蟮慕Y(jié)構(gòu)如圖2。此化合物曾經(jīng)報(bào)道有合成的[10]，而作為天然產(chǎn)物提取物尚未見報(bào)道。

圖2 化合物Ⅲ的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.2 Chemical structure of compound Ⅲ

2.2 化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的體外抗氧化活性

2.2.1 對DPPH自由基的清除能力

圖3 化合物體外清除DPPH自由基的能力Fig.3 DPPH free radical scavenging activity of compoundsⅠ,Ⅱ and Ⅲ

在3個(gè)分離得到的純化合物中，化合物Ⅲ具有較強(qiáng)的清除DPPH自由基的活性，其半抑制率質(zhì)量濃度為0.026mg/mL。新化合物Ⅰ具有微弱的清除DPPH自由基活性，在實(shí)驗(yàn)最高質(zhì)量濃度1mg/mL時(shí)對DPPH自由基的清除率只有29.33%(圖3)，而化合物Ⅱ在實(shí)驗(yàn)過程中沒有顯示對DPPH自由基有清除作用。由圖3可直觀地看出，在質(zhì)量濃度大于或等于0.2mg/mL時(shí)化合物Ⅲ對DPPH自由基的清除率逐漸高于同質(zhì)量濃度下的BHT。

2.2.2 對金屬的螯合能力3個(gè)純化合物對金屬離子螯合作用很微弱(圖4)?；衔铫箅m然有很強(qiáng)的清除DPPH自由基的作用，但對金屬離子的螯合作用卻很弱。說明化合物Ⅲ的抗氧化活性體現(xiàn)在對自由基的清除能力較強(qiáng)，化合物Ⅲ對于其他自由基如羥自由基、超氧陰離子自由基等的影響有待進(jìn)一步研究。

圖4 化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ對金屬離子的螯合能力Fig.4 Fe2+ chelating ability of compounds Ⅰ,Ⅱ and Ⅲ

表2 3種化合物對細(xì)菌的抑制作用Table2 Antimicrobial activities of compoundsⅠ,Ⅱ and Ⅲ

2.3 化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ抑菌活性

用不同質(zhì)量濃度的化合物分別對4種細(xì)菌做抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

由表2可見，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)化合物Ⅱ?qū)ψ儺愭溓蚓幸欢ǖ囊种谱饔?，對金黃色葡萄球菌有著較強(qiáng)的抑制作用，而對大腸桿菌和沙門氏菌顯示較弱的抑制作用；化合物Ⅲ對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門氏菌僅顯示出微弱的抑制作用；化合物Ⅰ也顯示出與化合物Ⅲ相似的抑菌趨勢，但作用更弱。

3 結(jié) 論

從絞股藍(lán)中分離出3個(gè)木脂素類化合物， 3個(gè)木脂素類化合物中只有化合物Ⅲ有較強(qiáng)的清除DPPH自由基的能力，化合物Ⅰ只有微弱的清除能力，而化合物Ⅱ在實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)沒有顯示出對DPPH自由基的清除作用，3種化合物對金屬的螯合能力在實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)都很低。

變異鏈球菌(Streptococcus mutans)是寄生于人口腔中的微生物，是引起人類齲齒的主要微生物之一；金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和大腸桿菌是常見的食源性致病菌。3種化合物在一定程度上對4種細(xì)菌顯示抑制其生長的作用。

[1] 中國科學(xué)院昆明植物研究所.云南植物志[M].北京:科學(xué)出版社,1995: 389-390.

[2] BLUMERT M, LIU Jialiu.Jiaogulan-China, s " immortality" herb[M].Badger: Torchlight Publishing Inc, 1999.

[3] 齊剛, 張莉.絞股藍(lán)的藥理作用研究進(jìn)展[J].武警醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2003,12(3): 239-241.

[4] LIU Xin, YE Wencai, MO Ziyao, et al.Three dammarane-type saponins fromGynostemma pentaphyllum[J].Planta Medica, 2005, 71(9): 880-884.

[5] FENG Yin, HU Lihong.Studies on chemical constituent of Jiaogulan(Gynostemma pentaphyllum)[J].ACS Symposium Series, 2006, 925:170-184.

[6] 曾曉黎.絞股藍(lán)的體外抗菌活性實(shí)驗(yàn)[J].中成藥, 1999, 21(6): 308-310.

[7] YAMAGUCHI T, TAKAMURA H, MATOBA T, et al.HPLC method for evaluation of the free radical-scavenging activity of foods by using 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl[J].Biosci Biotechnol Biochem, 1998, 62(6): 1200-1204.

[8] DINIS T C, MADERIA V M, ALMEIDA L M.Action of phenolic derivates (acetaminophen, salycilate and 5-aminosalycilate) as inhibitors of membrane lipid peroxidation and as peroxyl radical scavenger[J].Arch Biochem Biocphys, 1994, 315(1): 161-169.

[9] WANG Xiaowen, ZHANG Huaping, CHEN Feng, et al.A new lignan fromGynostemma pentaphyllum[J].Chinese Chemical Letters, 2009, 20(5): 589-591.

[10] PIETERS L, van DYCK S, GAO M, et al.Synthesis and biological evaluaton of dihydrobenzofuran lignans and related compounds as potential antitumor agents that inhibit tubulin polymerization[J].Journal of Medicinal Chemistry, 1999, 42(26): 5475-5481.