朱均旺，鞠興榮,*，王立峰,2，袁 建，何 榮,2

(1.南京財經(jīng)大學食品科學與工程學院，江蘇省糧油品質(zhì)控制及深加工技術(shù)重點實驗室，江蘇 南京 210003；2.江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122)

脫脂菜籽餅粕含有30%～40%的優(yōu)質(zhì)蛋白，營養(yǎng)價值優(yōu)于任何其他植物蛋白，是一種理想的、潛在的優(yōu)質(zhì)蛋白資源[1]。之前已經(jīng)對超聲波輔助反膠束法萃取菜籽蛋白進行了研究，獲得了優(yōu)質(zhì)的菜籽蛋白。與傳統(tǒng)方法相比，反膠束法萃取的蛋白溶解性、發(fā)泡性和發(fā)泡穩(wěn)定性都比較好[2]；蛋白所含的亞基比例有明顯的減少，彌補了傳統(tǒng)方法回收中低分子蛋白困難的缺陷[3]；由于反膠束溶液的水層和極性頭的保護，所得蛋白質(zhì)失活或變性程度很小[4]。這些都為后面的酶解研究提供了優(yōu)質(zhì)的原料。

蛋白質(zhì)經(jīng)酸水解、酶解等方法處理后都可得到肽，但酶促反應的條件溫和，反應易于控制、專一性較強、副產(chǎn)物少，食用安全性有保障[5]，而且菜籽蛋白水解成多肽或氨基酸后，生物活性和加工特性也隨之提高[6-7]，是菜籽肽制備的理想選擇。

本實驗利用分步酶解法，先利用內(nèi)切酶從蛋白質(zhì)分子內(nèi)部切斷肽鍵的多肽，生成胨和多肽等中間產(chǎn)物，再由外切酶將疏水性氨基酸從多肽鏈的端基切下[8]，以選擇合適的復合酶。再結(jié)合超聲波技術(shù)，使酶解液中產(chǎn)生空化作用，以獲得良好的酶解效果，促進酶解反應及制備優(yōu)質(zhì)的小分子量菜籽肽。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選用實驗室自制的雙低菜籽粕[9]，進行酸洗后利用超聲波輔助反膠束法萃取菜籽粕蛋白，所得雙低菜籽粕蛋白液中蛋白質(zhì)含量為45%。

堿性蛋白酶Alcalase 2.4L、復合風味酶Flavourzyme 500MG、復合蛋白酶、木瓜蛋白酶 丹麥Novozymes公司；胰蛋白酶 美國Amresco公司；L-酪氨酸、干酪素 中國惠興生化試劑公司；其他化學試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

TDL-5-A離心機、GL-20B型高速冷凍離心機 上海安亭科學儀器廠；pHS-3C型精密數(shù)顯pH計 上海精密科學儀器廠；KQ-100E型超聲波清洗器 昆山超聲儀器有限公司；UV-2401PC紫外-可見分光光度計日本Shimadzu公司；AKTA蛋白純化系統(tǒng) 美國通用電氣公司。

1.3 方法

1.3.1 酶活力測定

采用紫外光譜法[10]測定。

1.3.2 復合酶水解菜籽粕蛋白液

將木瓜蛋白酶、復合蛋白酶、堿性蛋白酶、復合風味酶、胰蛋白酶按表1組成6個復合酶。

表1 復合酶組成Table1 Pairwise combinations among papain, protamex, alcalase,flavourzyme and trypsin

取雙低菜籽粕蛋白液，配制成質(zhì)量分數(shù)5%的菜籽粕分離蛋白液，經(jīng)過超聲波預處理5min[11-12]。調(diào)節(jié)溶液至酶的最佳水解條件(表2)。加1U/g蛋白的酶a，施加超聲波20min[1]，迅速移至水浴振蕩器中。在整個酶解過程需要保持溫度不變，同時用NaOH(HCl)溶液維持pH值恒定(±0.1pH單位)。2h后，取酶解液，置于沸水浴中鈍化蛋白酶，冷卻。再調(diào)節(jié)溶液至酶b的最佳水解條件，加1U/g蛋白的酶b，重復上述操作，所得酶解液，置于沸水浴中鈍化蛋白酶，冷卻后置于冰箱內(nèi)，以備分析。

表2 各種蛋白酶的最佳水解條件和酶活力Table2 Optimum reaction conditions of papain, protamex, alcalase,flavourzyme and trypsin and corresponding enzyme activities

1.3.3 水解度測定

按照凱氏定氮法測定總氮(TN)和中性甲醛滴定法[13]測定酶解液中游離氨態(tài)氮(AN)。

1.3.4 三氯乙酸氮溶解系數(shù)(TCA-NSI)的測定[14]

取5mL菜籽蛋白酶解液于具塞離心管中，加入20%的TCA溶液5mL，混合均勻后放置10min，然后在2000×g下離心，取8mL上層清液和4mL蛋白溶液，分別進行處理和測定。

1.3.5 多肽含量測定[15]

取一定量的處理液，加入等體積10%的三氯乙酸，靜置30min，2～4℃下10000×g離心15min，取2mL上清液，加8mL雙縮脲試劑，25℃下靜置30min，測OD540nm值。按公式(3)計算肽得率。

1.3.6 菜籽多肽相對分子質(zhì)量分布的測定

采用凝膠過濾色譜法測定。色譜條件：Superose12 10/300 GL(10mm×300mm)柱；流動相50mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.0)，0.15mol/L NaCl；流速0.5mL/min；進樣體積500μL；檢測波長215nm。分子質(zhì)量標品為牛血清白蛋白(67kD)、細胞色素(12.7kD)、鈷胺酰胺(VB12，1355D)、Gly-Gly-Tyr-Arg(451.48D)。處理液稀釋5倍后測量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)均采用±s來表示；用t檢驗進行顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 肽含量標準曲線

取不同體積的Gly-Gly-Tyr-Arg標準溶液，按照樣品測定方法顯色，于波長540nm處測OD值，繪制Gly-Gly-Tyr-Arg標準曲線(圖1)，得到回歸方程y=0.0259x+0.0039(R2=0.9992)。

圖1 Gly-Gly-Tyr-Arg標準曲線Fig.1 Standard curve of Gly-Gly-Tyr-Arg

2.2 不同復合酶水解對水解度的影響

圖2 不同復合酶水解對水解度的影響Fig.2 Influence of different enzyme combinations on the DH of rapeseed meal protein

為了篩選出適于制備優(yōu)質(zhì)小分子質(zhì)量菜籽肽的酶，首先考察分步酶解后水解度的變化，結(jié)果見圖2。分步酶解的水解度基本高于楊柳等[16]報道的單酶水解度。說明先內(nèi)切酶作用，后外切酶作用有利于切除菜籽粕蛋白中豐富的肽鍵[7]；也可能是超聲波能有效地促進蛋白質(zhì)的酶解，使其水解度提高[17]。E5和E3是對此種菜籽粕蛋白水解能力最強的復合酶?？赡苁莾煞N復合酶均有復合風味酶，這是一種內(nèi)切酶和外切酶的混合酶，可有效地將疏水性氨基酸從蛋白質(zhì)末端切除，利于把蛋白質(zhì)切成小分子肽。同時，水解度的大小對肽段長度、游離氨基酸的相對含量有重要影響，客觀上反映了水解產(chǎn)物分子量的大小[18]。說明與其他復合酶相比，E5和E3兩種復合酶制備的菜籽多肽中可能含有較多的低分子量肽。

2.3 不同復合酶的水解對三氯乙酸氮溶解指數(shù)(TCANSI)的影響

圖3 不同復合酶的水解對三氯乙酸氮溶解指數(shù)的影響Fig.3 Influence of different enzyme combinations on the TCANSI

圖3反映了酶解液在三氯乙酸作用后的氮溶解指數(shù)，是樣品中能夠溶于特定溶劑中的氮占總氮的百分率，TCA-NSI的高低反映了酶解產(chǎn)物的生化特性。除E4外其他5種復合酶的水解液的TCA-NSI數(shù)值都比較高，說明酶解物中肽的酸溶性均比較好。說明木瓜蛋白酶和復合蛋白酶的組合不適宜制備小分子菜籽肽。由于菜籽粕蛋白中氨基酸組成和含量豐富[19]，胰蛋白酶和木瓜蛋白酶均屬于特異性的氨基酸內(nèi)切酶，能有效地酶解菜籽粕蛋白中的絲氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、組氨酸、蛋氨酸，制備的小分子菜籽肽具有良好酸溶性，以致在體內(nèi)消化吸收也比較快，蛋白質(zhì)利用率較高。

2.4 不同復合酶的水解對菜籽肽得率的影響

圖4 不同復合酶水解對菜籽肽得率的影響Fig.4 Influence of different enzyme combinations on the peptide yield

從圖4可以發(fā)現(xiàn)，不同的復合酶作用所得酶解液的肽得率變化趨勢和圖3的TCA-NSI變化基本一致。說明肽得率和肽的酸溶性存在一定關系，可能是此種菜籽粕蛋白在酸溶液中較容易被酶解為小肽，需要進一步研究。復合酶E6、E2、E3和E5作用后所得的酶解液肽得率比較高，說明胰蛋白酶與外切酶結(jié)合、木瓜蛋白酶與復合風味酶組合，可能會有效地把蛋白質(zhì)羧基端疏水性氨基酸的肽鍵切斷[20]。也可能是由于底物的某些成分對E1和E4有一定的抑制作用，導致所得產(chǎn)物中許多肽鍵不能有效分解。有研究[21]指出三氯乙酸可溶性部分的肽組成不超過4個氨基酸殘基，因此三氯乙酸可溶性氮的多少也能夠很好地反應出蛋白酶分解蛋白質(zhì)的能力。

2.5 不同復合酶水解對菜籽肽相對分子質(zhì)量分布的影響

為了進一步研究超聲波輔助分步驟酶解法制備優(yōu)質(zhì)的小分子量菜籽肽，對上述6個復合酶作用的酶解液進行處理，用凝膠過濾色譜研究菜籽肽相對分子質(zhì)量的變化情況，結(jié)果見圖5。

圖5 不同復合酶的水解對菜籽肽相對分子質(zhì)量分布的影響Fig.5 Influence of different enzyme combinations on the molecular weight distribution of the peptides in the hydrolysate

從圖5可以看出，這6種復合酶均能分解得到相對分子質(zhì)量在3000以下的多肽，但相對分子質(zhì)量分布不一。小分子量肽含量的分布與水解度高低趨勢基本一致。復合酶E3和E5酶解后產(chǎn)生了較多的小分子量的物質(zhì)，酶解液中紫外吸收較強，產(chǎn)量較高，有較多的小分子量的多肽，效果最佳。色譜法對酶解處理液中物質(zhì)的相對分子質(zhì)量分布分析結(jié)果與上述化學分析結(jié)果基本一致。

3 結(jié) 論

本研究利用超聲波輔助分步酶解法水解，反膠束法萃取得到的菜籽粕蛋白液，主要利用酶的水解能力生產(chǎn)菜籽多肽。綜上4個指標水解度、三氯乙酸氮溶解指數(shù)、菜籽肽得率和菜籽肽相對分子質(zhì)量分布，可得出以下結(jié)論：

3.1 堿性蛋白酶與復合風味酶、木瓜蛋白酶與復合蛋白酶，這兩個復合酶對此種菜籽粕蛋白的水解能力相對較差，5個指標均比較低。堿性蛋白酶與復合蛋白酶、胰蛋白酶與復合蛋白酶，雖然都有較高的肽得率，所得肽的酸溶性也較高，但其水解度都比較低，影響了低分子量肽的產(chǎn)生。因此，這4種復合酶不足以作為本實驗制備目標菜籽肽的理想用酶。

3.2 木瓜蛋白酶與復合風味酶、胰蛋白酶與復合風味酶，分步酶解的產(chǎn)物水解度比較高，多肽得率也比較高，其中所含小分子量的肽也比較多；而且復合風味酶能夠脫除菜籽粕蛋白水解液中的苦味，增進和改善水解液的風味，比較適宜本實驗制備優(yōu)質(zhì)小分子量菜籽肽以及進行后續(xù)研究。

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