郭杰標，許 楊，劉師文

(南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，中德聯(lián)合研究院，江西 南昌 330047)

氟喹諾酮是一類強效、廣譜的合成抗菌素，通過抑制細菌DNA解旋酶發(fā)揮抗菌效力[1]。這類藥物在畜牧、水產業(yè)被廣泛應用治療和預防細菌感染，并作為飼料添加劑促進動物的生長[2]。恩諾沙星是獸藥領域最常用的氟喹諾酮藥物，我國制定了在食品中恩諾沙星及其代謝產物環(huán)丙沙星的總殘留限量標準(MRLs)，以避免這兩種藥物在食品中的殘留所造成的細菌耐藥性和過敏反應等健康危害。

目前，檢測食品中恩諾沙星及環(huán)丙沙星總殘留量的主要微生物法[1]和儀器學方法，包括液相色譜和液相色譜-質譜[3-6]，毛細管電泳[7]等。微生物法檢測周期長，而儀器學方法需要昂貴的設備且運行費用高，難以在基層檢測部門廣泛推廣。檢測一種氟喹諾酮藥物[8-10]和檢測氟喹諾酮藥物總量[11-13]的免疫學方法已有報道，但是同時檢測食品中恩諾沙星及環(huán)丙沙星總殘留量的免疫學法還有待開發(fā)。恩諾沙星和環(huán)丙沙星的分子結構式見圖1，本研究采用環(huán)丙沙星作為代表半抗原制備人工抗原，并將其免疫動物，獲得針對恩諾沙星和環(huán)丙沙星的抗體，為建立同時檢測這兩種藥品總殘留量的免疫學快速檢測方法提供條件。

圖1 恩諾沙星和環(huán)丙沙星的分子結構式Fig.1 Molecular structures of enrofloxacin and ciprofloxacin

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

恩諾沙星和環(huán)丙沙星 中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；弗氏完全(不完全)佐劑、戊二醛、葡萄糖、乳糖、牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OVA) 上海生工生物工程技術服務有限公司；山羊抗鼠IgG-HRP酶標二抗 Gene Tex公司；96孔酶標板 Costar公司；其他試劑均為國產分析純。

Ultrospec紫外-可見光掃描儀 美國安瑪西亞公司；Multiskan MCC/340酶標儀 Labsystems公司。

1.2 實驗動物

Balb/c小鼠(雌性，4周齡)購自南昌大學醫(yī)學院實驗動物中心(批準號為：贛(動)96-021)。

1.3 方法

1.3.1 糖基化牛血清白蛋白的制備[14]

葡萄糖、乳糖和載體蛋白按照20:20:1的物質的量比混合，調節(jié)至pH9.5，在40～42℃振蕩2h，使還原糖上的醛基與蛋白質的氨基發(fā)生偶聯(lián)，完成對載體蛋白的牛血清白蛋白糖基化修飾。

1.3.2 環(huán)丙沙星免疫抗原的制備

把糖基化BSA的質量濃度固定為2mg/mL，戊二醛投料質量濃度固定為60.6μg/mL，環(huán)丙沙星投料質量濃度分別為0.85、1.06、1.27mg/mL。調節(jié)pH9.5在25℃振蕩12h，合成3種不同偶聯(lián)比的環(huán)丙沙星免疫抗原。用0.05mol/L PBS(pH7.4)透析3d，備用。

1.3.3 環(huán)丙沙星檢測抗原的制備

OVA的質量濃度為2mg/mL，戊二醛的投料質量濃度為44.4μg/mL，環(huán)丙沙星的投料質量濃度0.62mg/mL。調節(jié)pH9.5在25℃振蕩12h，合成環(huán)丙沙星檢測抗原。用0.05mol/L PBS (pH7.4)透析3d，備用。

1.3.4 環(huán)丙沙星人工抗原偶聯(lián)比例的計算

環(huán)丙沙星區(qū)別于載體蛋白的特征吸收波長為340nm，在該波長下的摩爾消光系數K=4.5mL/mg，人工抗原蛋白濃度的測定使用雙縮脲法[15]。

1.3.5 小鼠免疫

取4周齡的雌性Balb/c小鼠，以100μg/只的抗原劑量，加完全佐劑充分乳化后，皮下多點初次免疫。28d后，以不完全佐劑乳化抗原以加強免疫。之后每21d，以同樣的方法進行加強免疫。對照組采用非糖基化載體制備的免疫抗原進行免疫。

1.3.6 抗體效價檢測

參照Guo等[16]的方法，分別采用間接ELISA和間接競爭ELISA，測定免疫后小鼠血清的抗體效價和抗體對環(huán)丙沙星的特異性。

1.3.7 單克隆抗體篩選與鑒定

參照Guo等[16]的方法，篩選得到分泌抗環(huán)丙沙星單克隆抗體的雜交瘤細胞。并用間接競爭ELISA對所獲得抗體的特性進行鑒定。

2 結果與分析

2.1 人工抗原的合成

環(huán)丙沙星人工抗原的制備原理見圖2。戊二醛是雙功能試劑，通過和蛋白質上的氨基和環(huán)丙沙星哌嗪環(huán)上的亞氨基反應，可以實現(xiàn)環(huán)丙沙星和載體蛋白之間連接，使恩諾沙星和環(huán)丙沙星的共同結構暴露在人工抗原的外部，成為主要的抗原位點。

圖2 人工抗原的合成Fig.2 Synthesis route of artificial antigen

環(huán)丙沙星人工抗原的連接效果，用紫外掃描圖譜進行評價(圖3)。按照1.3.2節(jié)制備的3種環(huán)丙沙星免疫抗原，經檢測偶聯(lián)比分別為6.3:1、7.2:1和8.3:1。按照1.3.3節(jié)制備的環(huán)丙沙星檢測抗原，經檢測偶聯(lián)比為2.4:1。

圖3 載體蛋白、環(huán)丙沙星和環(huán)丙沙星免疫抗原溶液的紫外掃描圖譜Fig.3 UV absorption spectra of glycosylated BSA, ciprofloxacin and ciprofloxacin immunogen

戊二醛是很活潑的連接劑，很容易與蛋白質的氨基反應造成蛋白質聚集。圖4是分別以糖基化載體和天然載體制備的環(huán)丙沙星抗原免疫的SDS PAGE圖譜。泳道3顯示，使用天然BSA制備的免疫抗原，在戊二醛作用下造成了載體蛋白蛋白的聚集。

圖4 天然BSA和糖基化BSA制備的環(huán)丙沙星免疫抗原SDS-PAGE圖譜Fig.4 SDS-PAGE patterns of ciprofloxacin immunogens prepared with native BSA and glycosylated BSA

葡萄糖、乳糖是還原糖，分子結構中含有醛基，在偏堿性條件葡萄糖和乳糖會與BSA上的氨基縮合，把蛋白上的氨基封閉。泳道4顯示，經過糖基化BSA分子質量比天然BSA(泳道2)增大。泳道5顯示，以糖基化BSA為載體制備的環(huán)丙沙星免疫抗原，由戊二醛導致的蛋白質聚集現(xiàn)象得到了避免。

由此可見，使用糖基化載體制備環(huán)丙沙星免疫抗原，由于載體蛋白上的氨基數量減少，能夠避免載體蛋白的聚集，同時增加環(huán)丙沙星免疫抗原的分子質量。

2.2 免疫小鼠效果

圖5 糖基化載體和天然載體制備的抗原免疫小鼠的效果比較Fig.5 Comparison of antiserum titer induced by ciprofloxacin immunogens prepared with native BSA and glycosylated BSA

本研究使用糖基化BSA為載體，如1.3.2節(jié)合成的3種偶聯(lián)比的糖基化環(huán)丙沙星免疫抗原。前期合成的以天然BSA為載體制備環(huán)丙沙星免疫抗原中，免疫動物效果最好的是偶聯(lián)比為9.1:1的抗原。本實驗以天然BSA為載體制備的環(huán)丙沙星免疫抗原作對照，評價3種糖基化環(huán)丙沙星抗原免疫小鼠的效果。4種抗原免疫小鼠后抗體效價的上升曲線見圖5。結果發(fā)現(xiàn)使用糖基化BSA為載體制備的3種免疫抗原，比對照抗原誘導小鼠產生抗環(huán)丙沙星特異性抗體的能力要強很多。

2.3 單克隆抗體的篩選與鑒定

本實驗使用免疫效果最好的糖基化免疫抗原，在第4次免疫之后獲得了較高的抗體效價。通過細胞融合，順利獲得了檢測環(huán)丙沙星及其代謝前體恩諾沙星的單克隆抗體(1G3)。經用間接競爭ELISA進行鑒定，該抗體對這兩種藥品的IC50值分別為9.6ng/mL和10.2ng/mL，靈敏度和特異性能夠滿足同時檢測這兩種藥品在食品中的殘留的需要。

3 討 論

環(huán)丙沙星是小分子物質，沒有免疫原性，必須與載體蛋白偶聯(lián)后才可以免疫動物產生抗體。經過分析和比較，發(fā)現(xiàn)把環(huán)丙沙星分子中哌嗪環(huán)上的亞氨基作為連接位點制備的人工抗原，有利于獲得針對恩諾沙星和環(huán)丙沙星共同結構的抗體。

有文獻報道，制備人工抗原的連接臂的最適長度在3～6個碳原子，連接臂太短不利于半抗原的充分暴露，而連接臂太長又會造成折疊導致半抗原分子被載體蛋白掩蓋不利于產生抗體[17]，戊二醛作為連接手臂正好符合3～6個碳原子的條件。戊二醛在堿性條件下可以與氨基或亞氨基縮合，能夠把環(huán)丙沙星上的亞氨基連接到蛋白載體上。

戊二醛是很活潑的連接劑，很容易與蛋白質的氨基反應造成蛋白質聚集。使用糖基化載體制備免疫抗原，能夠避免載體蛋白的聚集，同時增加環(huán)丙沙星免疫抗原的分子質量和免疫原性。通過免疫動物和細胞融合，篩選出了一株對恩諾沙星和環(huán)丙沙星IC50值分別為9.6ng/mL和10.2ng/mL的單克隆抗體，為建立同時檢測這兩種藥品總殘留量的免疫學快速檢測方法提供了條件。

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