陳 國，肖雅琴，陳宏文

(華僑大學(xué)化工學(xué)院，工業(yè)生物技術(shù)福建省高校重點實驗室，福建 廈門 361021)

羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)常棲息于人和動物的腸道系統(tǒng)中，對人和動物無害，具有良好的生物相容性。它代謝甘油產(chǎn)生一種特殊的抑菌物質(zhì)——羅伊氏素(reuterin)，其主要成分是3-羥基丙醛(3-HPA)的單體、水合物和環(huán)化二聚體[1]。

羅伊氏素中的主要成分3-HPA單體是一種潛在的重要化工原料，可作為多種新興化學(xué)品如丙烯醛、丙烯酸、1,3-丙二醇(1,3-propanediol, 1,3-PD)等的前體，用于制備新型聚合物材料[1]；可和蛋白質(zhì)中的氨基反應(yīng)形成交聯(lián)，有望取代化學(xué)合成的戊二醛和環(huán)氧化合物作為新型生物交聯(lián)劑[2-3]；可抑制革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、酵母菌、霉菌、病原蟲、原生動物等的生長[4-6]，正逐步被開發(fā)成新型廣譜抗菌劑，包括用作生物防腐劑[7-8]、生物滅菌劑[9]、口香糖添加劑[10]和抗感染治療劑[11]。瑞典BioGaia 公司已經(jīng)開發(fā)了一系列包含L.reuteri的益生菌制劑，在全世界范圍內(nèi)銷售，用于改善人和動物的健康水平。我國衛(wèi)生部也于2003年批準羅伊氏乳桿菌作為保健食品益生菌種。但對其培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的優(yōu)化簡化少見于文獻。因此，研究L.reuteri的生長及代謝具有重要意義，將為L.reuteri發(fā)酵甘油制備3-HPA提供參考。

響應(yīng)面分析法(response surface methodology，RSM)是一種優(yōu)化工藝條件的有效方法，中心組合設(shè)計(CCD)可用于確定實驗因素及其交互作用對指標響應(yīng)值的影響，精確表述因素和響應(yīng)值之間的關(guān)系[12]。本實驗先進行單因素試驗確定氮源，再用Plackett-Burman設(shè)計考察L.reuteriCG001 MRS培養(yǎng)基、pH值及培養(yǎng)溫度，篩選出4個關(guān)鍵因素，進一步用CCD設(shè)計對關(guān)鍵因素進行響應(yīng)面優(yōu)化分析，得到最優(yōu)培養(yǎng)條件，最終在成本降低的情況下獲得更高菌體質(zhì)量濃度。最優(yōu)條件下在發(fā)酵罐中厭氧培養(yǎng)L.reuteriCG001，測定其基本生長代謝情況。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種：羅伊氏乳桿菌(L.reuteriCG001)由工業(yè)生物技術(shù)福建省高校重點實驗室篩選保藏。

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨 10g、牛肉膏 10g、酵母浸膏 5g、葡萄糖 20g、磷酸氫二鉀 2g、醋酸鈉 5g、檸檬酸銨 2g、硫酸鎂 0.2g、硫酸錳 0.05g、吐溫-80 1g，蒸餾水1000mL，pH 6.2～6.6。

1.2 方法

1.2.1 MRS培養(yǎng)基的配制及菌種的培養(yǎng)

配制MRS培養(yǎng)基，充氮氣并加膠塞和鋁蓋，滅菌后按體積分數(shù)1%接種，37℃靜置培養(yǎng)。最優(yōu)條件下以5%接種量于發(fā)酵罐中培養(yǎng)時，以恒定流速充氮氣保證其厭氧環(huán)境，攪拌轉(zhuǎn)速200r/min，pH5.5。

1.2.2 菌體質(zhì)量濃度的測定

建立光密度(OD600nm)與干質(zhì)量濃度(cell dry weight，CDW)的標準曲線，測OD600nm換算菌體質(zhì)量濃度。

1.2.3 發(fā)酵上清液中葡萄糖、乳酸、乙酸和乙醇質(zhì)量濃度的測定

采用HPLC法：AminexHPX-87H柱，柱溫60℃，流動相為5mmol/L硫酸，流速0.6mL/min，示差折光檢測器(RID)，手動進樣20μL。

1.3 實驗設(shè)計

以菌體質(zhì)量濃度為響應(yīng)指標，采用3步進行優(yōu)化：首先進行單因素試驗確定氮源；其次運用Plackett-Burman設(shè)計選出對響應(yīng)值影響較大的幾個因素；然后再采用響應(yīng)面法中的CCD進行試驗，通過實驗數(shù)據(jù)擬合得到二階響應(yīng)面模型，最終確定最優(yōu)實驗條件，并進行驗證實驗。

1.3.1 菌體生長氮源的選擇

原始MRS培養(yǎng)基是富集培養(yǎng)基，其中含蛋白胨、牛肉膏和酵母膏3種氮源，為降低成本并與大豆蛋白胨、玉米漿干粉及酵母粉進行比較，用單因素試驗篩選出滿足菌體生長的單一氮源。試驗中各種氮源的質(zhì)量濃度保持一致，為10g/L，培養(yǎng)基的其他因素及水平不變。

1.3.2 Plackett-Burman設(shè)計對試驗因素的篩選

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，應(yīng)用Design Expert軟件對MRS培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件進行Plackett-Burman設(shè)計(表1)。以菌體質(zhì)量濃度為響應(yīng)值，對影響菌體生長的10個主要因素進行篩選：即酵母膏、葡萄糖、檸檬酸銨、醋酸鈉、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸錳和吐溫-80的質(zhì)量濃度，初始pH值，培養(yǎng)溫度，外加一個虛擬變量。每個變量分別確定高(+1)和低(－1)兩個水平，共進行12次試驗以確定每個因素的影響水平。

表1 Plackett-Burman設(shè)計各因素水平Table1 Factors and levels in the Plackett-Burman design

Plackett-Burman試驗設(shè)計中，應(yīng)用線性函數(shù)進行因素篩選并忽略相互作用。對軟件擬合的線性方程進行方差分析及顯著性分析，評價各因素的效應(yīng)及重要性。

1.3.3 CCD方法對主要因素水平的篩選

由Box和Wilson開發(fā)的CCD可通過最少的實驗來擬合響應(yīng)面模型，每個因素通常設(shè)計5個水平，一般采用二階經(jīng)驗?zāi)Ｐ蛯ψ兞康捻憫?yīng)行為進行表征[12]。

應(yīng)用Design Expert軟件，采用CCD方法，對Plackett-Burman篩選出的4個主要因素(酵母膏質(zhì)量濃度、葡萄糖質(zhì)量濃度、硫酸錳質(zhì)量濃度和培養(yǎng)溫度)進行試驗設(shè)計(表2)。同時根據(jù)Plackett-Burman設(shè)計擬合出的線性方程，若偏回歸系數(shù)為正值表明該因素起正效應(yīng)，取高水平；若系數(shù)為負值則表明該因素起負效應(yīng)，取低水平，固定其他非關(guān)鍵因素。

表2 CCD各因素水平Table2 Factors and levels in the central composite design

2 結(jié)果與分析

2.1 菌體生長氮源選擇試驗結(jié)果

圖1 不同氮源對菌體質(zhì)量濃度的影響Fig.1 Effect of nitrogen source type on the growth of L.reuteri CG001

由圖1可以看出，不同氮源對菌體質(zhì)量濃度的影響較大，綜合成本最低和滿足菌體生長需要兩方面考慮，酵母膏作為氮源最合適。

2.2 Plackett-Burman設(shè)計試驗結(jié)果

應(yīng)用Design Expert軟件對表3中菌體質(zhì)量濃度進行回歸分析，得到各影響因素的偏回歸系數(shù)及其顯著性，結(jié)果見表4。

表4 偏回歸系數(shù)及影響因素的顯著性分析Table4 Partial regression coefficients and corresponding significance analysis

式中：Y為菌體質(zhì)量濃度/(g/L)；A、B、C、D、E、F、G、J、L分別表示Plackett-Burman設(shè)計中各因素的水平。

由表4可以看出，此模型的F值是24.28，表明該擬合模型很顯著，并且僅僅只有4.02% 的機會是由于噪聲引起的。方差分析模型的Prob＞F值為0.0402小于0.05，表明所得回歸方程顯著，即該模型的整個回歸區(qū)域擬合較好；復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.9909，說明相關(guān)性很好；校正決定系數(shù)R2Adj=0.9501，表明95.01%試驗數(shù)據(jù)的變異性可用此回歸模型來解釋；通常情況下變化系數(shù)(C V)越低實驗的可信度和精確度越高，本試驗CV=4.80，表明Plackett-Burman試驗的可信度和精確度很好；精密度(adeq precision)是有效信號與噪聲的比值，

表3 Plackett-Burman試驗設(shè)計結(jié)果Table3 Plackett-Burman design matrix and experimental results

大于4.0視為合理，本試驗精密度達到14.972。另外，通過偏回歸系數(shù)的正負值確定非關(guān)鍵因素如下：檸檬酸銨質(zhì)量濃度1g/L、醋酸鈉質(zhì)量濃度7g/L、磷酸氫二鉀質(zhì)量濃度3g/L、硫酸鎂質(zhì)量濃度0.2g/L、吐溫-80質(zhì)量濃度1g/L、初始pH6.2。

2.3 CCD試驗結(jié)果與響應(yīng)面分析

表5 CCD試驗結(jié)果Table5 Central composite design matrix and experimental results

式中：Y為響應(yīng)值，即菌體質(zhì)量濃度/(g/L)；A、B、C分別為酵母膏質(zhì)量濃度/(g/L)、葡萄糖質(zhì)量/(g/L)濃度和硫酸錳質(zhì)量濃度/(g/L)；D為培養(yǎng)溫度/℃。

對二次模型的方差分析見表6。

表6 CCD試驗結(jié)果二次模型的方差分析Table6 Variance analysis for the developed regression model

由表6可知，F(xiàn)值為4.12，多元相關(guān)系數(shù)為R2=0.9058，說明模型對實際情況擬合比較好；Prob＞F值為0.0455，表明該模型擬合效果顯著。

表7 二次模型回歸方程系數(shù)顯著性檢驗Table74 Significance test for coefficients of the developed regression model

二次模型中回歸系數(shù)的顯著性檢驗(表7)表明：Prob＞F值為0.0334，小于0.05，所以因素A對菌體質(zhì)量濃度的線性效應(yīng)顯著；而因素B、C、D不顯著；Prob＞F值為0.0487，小于0.05，所以因素D2對菌體質(zhì)量濃度的曲面效應(yīng)顯著，而因素A2、B2和C2不顯著；AB、AC、AD、BC、BD、CD對菌體質(zhì)量濃度的交互影響都不顯著。

應(yīng)用Design Expert軟件對多元回歸方程(2)繪制響應(yīng)曲面圖及其等高線圖。對任何兩因素交互影響L.reuteriCG001的菌體質(zhì)量濃度進行分析與評價，以確定最佳因素水平，結(jié)果見圖2～7。根據(jù)響應(yīng)面法原理，當?shù)雀呔€圖為橢圓或圓時，它的中心是響應(yīng)值的最大值或最小值，若未出現(xiàn)，則說明各因素交互作用不顯著。

圖2 酵母膏和葡萄糖對菌體質(zhì)量濃度交互影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.2 Response surface and contour plots illustrating the cross-interaction effect between yeast extract and glucose on the growth of L.reuteri CG001

圖2顯示，酵母膏質(zhì)量濃度和葡萄糖質(zhì)量濃度對菌體質(zhì)量濃度的交互影響不顯著。

圖3 酵母膏和硫酸錳對菌體質(zhì)量濃度交互影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.3 Response surface and contour plots illustrating the crossinteraction effect between yeast extract and manganese sulfate on the growth of L.reuteri CG001

圖3顯示，酵母膏質(zhì)量濃度和硫酸錳質(zhì)量濃度對菌體質(zhì)量濃度的交互影響不顯著。

圖4 酵母膏和培養(yǎng)溫度對菌體質(zhì)量濃度交互影響的相應(yīng)面圖和等高線圖Fig.4 Response surface and contour plots illustrating the crossinteraction effect between yeast extract and culture temperature on the growth of L.reuteri CG001

圖4顯示，酵母膏質(zhì)量濃度和培養(yǎng)溫度對菌體質(zhì)量濃度的交互影響不顯著。

圖5 葡萄糖和硫酸錳對菌體質(zhì)量濃度交互影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots illustrating the crossinteraction effect between glucose and manganese sulfate on the growth of L.reuteri CG001

圖5顯示，葡萄糖質(zhì)量濃度和硫酸錳質(zhì)量濃度對菌體質(zhì)量濃度的交互影響不顯著。

圖6 葡萄糖和培養(yǎng)溫度對菌體質(zhì)量濃度交互影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.6 Response surface and contour plots illustrating the crossinteraction effect between glucose and culture temperature on the growth of L.reuteri CG001

圖6顯示，葡萄糖質(zhì)量濃度和培養(yǎng)溫度對菌體質(zhì)量濃度的交互影響不顯著。

圖7 硫酸錳和培養(yǎng)溫度對菌體質(zhì)量濃度交互影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.7 Response surface and contour plots illustrating the cross interaction effect between manganese sulfate and culture temperature on the growth of L.reuteri CG001

圖7顯示，硫酸錳質(zhì)量濃度和培養(yǎng)溫度對菌體質(zhì)量濃度的交互影響極顯著，因為這是表5中21組實驗以外的情況，存在穩(wěn)定點并有最大值，對二次方程(2)求一階偏導(dǎo)得出坐標(C，D)=(0.3，0.73)，即硫酸錳質(zhì)量濃度為0.23g/L，培養(yǎng)溫度為38.6℃。

綜合Plackett-Burman試驗設(shè)計結(jié)果及響應(yīng)面分析，取軟件設(shè)計中的10組優(yōu)化條件中最好的一組(取值與上述不同)，確定最優(yōu)培養(yǎng)條件為：酵母膏質(zhì)量濃度20g/L、葡萄糖質(zhì)量濃度20g/L、硫酸錳質(zhì)量濃度0.23g/L、培養(yǎng)溫度38.6℃，理論計算菌體質(zhì)量濃度為0.997g/L。

2.4 驗證實驗

按照優(yōu)化后L.reuteriCG001的培養(yǎng)條件：酵母膏質(zhì)量濃度20g/L，葡萄糖質(zhì)量濃度20g/L，檸檬酸銨質(zhì)量濃度1g/L，醋酸鈉質(zhì)量濃度7g/L，磷酸氫二鉀質(zhì)量濃度3g/L，硫酸錳質(zhì)量濃度0.23g/L，硫酸鎂質(zhì)量濃度0.2g/L，吐溫-80質(zhì)量濃度1g/L，初始pH6.2，培養(yǎng)溫度38.6℃，進行驗證實驗，實測菌體質(zhì)量濃度達到0.984g/L，與預(yù)測菌體質(zhì)量濃度0.997g/L較接近，預(yù)測精度達98.69%，且最終菌體質(zhì)量濃度是優(yōu)化前的1.102倍。這證明了Plackett-Burman設(shè)計和CCD方法聯(lián)用的可行性，也證明了響應(yīng)面法應(yīng)用于培養(yǎng)基優(yōu)化的高效性。

2.5 發(fā)酵罐厭氧培養(yǎng)L.reuteri的生長代謝曲線與分析

圖8 5L發(fā)酵罐中L.reuteri CG001的生長曲線Fig.8 Growth curve of L.reuteri CG001 in a 5 L fermentor

圖8顯示，5L發(fā)酵罐厭氧培養(yǎng)L.reuteriCG001 的生長曲線呈S型，4～12h菌體處于對數(shù)生長期，之后趨于平衡，即可收獲菌體。

圖9 發(fā)酵液中葡萄糖、乳酸、乙酸和乙醇質(zhì)量濃度隨時間變化曲線Fig.9 Concentration versus time curves of glucose, lactic acid, acetic acid and ethanol during fermentation

從圖9可以看出，發(fā)酵上清液中葡萄糖的質(zhì)量濃度明顯下降至接近零，可知它的消耗速率與菌體的生長速率相對應(yīng)；乳酸和乙醇是葡萄糖代謝的產(chǎn)物，它們的質(zhì)量濃度都在上升，而乳酸產(chǎn)量居多；乙酸的質(zhì)量濃度從始至終變化不大，可能是因為培養(yǎng)基本身含有乙酸鈉，發(fā)酵過程 pH值 通過調(diào)節(jié)一直恒定在5.5左右導(dǎo)致的。菌體二步法轉(zhuǎn)化甘油制備3-HPA的研究中，第一步就是在最適菌生長的條件下獲得大量菌體，所以本實驗對L.reuteri的培養(yǎng)基進行優(yōu)化并對其生長代謝作基礎(chǔ)研究，這是二步法的前提。

3 結(jié) 論

大量前期的研究中羅伊氏乳桿菌的MRS培養(yǎng)基是富集培養(yǎng)基，組分較多，成本較高，實驗操作復(fù)雜。本實驗先用單因素法優(yōu)化氮源，再結(jié)合Plackett-Burman與CCD設(shè)計篩選出最優(yōu)配方，減少了培養(yǎng)基組分，降低了部分成本，使操作簡單化，并增加了菌體產(chǎn)量。

本實驗結(jié)果證明：Plackett-Burman設(shè)計方法可從影響培養(yǎng)基的多種組分中高效地篩選出關(guān)鍵因素；CCD設(shè)計和 RSM分析可實現(xiàn)關(guān)鍵因素的合理優(yōu)化，在降低培養(yǎng)基氮源成本的情況下，實測菌體質(zhì)量濃度達到0.984g/L，接近預(yù)測值0.997g/L，且最終菌體質(zhì)量濃度是優(yōu)化前的1.102倍。

用最優(yōu)條件在5L發(fā)酵罐中厭氧培養(yǎng)的L.reuteriCG001的生長曲線呈S型，4～12h是菌體的對數(shù)生長期，之后趨于平衡，即可收獲菌體。

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