張 京， 陳存社， 張 穎， 呼 德， 任雅琳

(北京工商大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院， 北京 100048)

共軛亞油酸(conjugated linoleic acid，CLA)是亞油酸(LA)的位置和幾何異構(gòu)體混合物的總稱，在脂肪酸鏈上碳的不同位置有兩個(gè)不飽和的共軛雙鍵. 它是人類近20年來發(fā)現(xiàn)的最重要的功能性脂肪酸之一，具有抗癌[1-2]、促進(jìn)生長、提高食物吸收率、增強(qiáng)免疫力和減少脂肪沉積[3]、抗粥狀動(dòng)脈硬化[4-5]等多種生理功能. 天然CLA主要存在于反芻動(dòng)物的肉制品和乳制品中，發(fā)酵制品中的CLA含量比相應(yīng)的非發(fā)酵產(chǎn)品中的含量高.

由于乳酸菌兼性厭氧，培養(yǎng)條件易于控制，無毒安全，同時(shí)乳酸菌含有的亞油酸異構(gòu)酶對(duì)作用底物具有很強(qiáng)的專一性，因此乳酸菌成為了生物合成CLA重點(diǎn)研究的菌種. 目前報(bào)道共有250株乳酸菌具有轉(zhuǎn)化LA生成CLA的能力. Ogawa J.等人通過研究嗜酸乳桿菌AKU 1137最早提出了亞油酸轉(zhuǎn)化生成共軛亞油酸的機(jī)理[6]. Akinori Ando, Jun Ogawa等人以植物乳桿菌JCM 1551的洗滌細(xì)胞作為蓖麻油酸產(chǎn)生CLA的催化劑，在最適條件下反應(yīng)99 h，5.0 g/L蓖麻油產(chǎn)生2.7 g/L CLA (產(chǎn)率0.027 g/L/h)；反應(yīng)171 h，30 g/L蓖麻油產(chǎn)生7.5 g/L CLA (產(chǎn)率0.044 g/L/h)[7]. 張中義等人也從酸菜汁中篩選出1株生成CLA能力較強(qiáng)的植物乳桿菌，發(fā)酵液中CLA生成量達(dá)到267.5 mg/L[8]. 郭焱等對(duì)徳氏乳桿菌保加利亞亞種1.148 2進(jìn)行誘變處理，篩選出一株共軛亞油酸高產(chǎn)菌株1 616 u，并優(yōu)化其培養(yǎng)條件，使發(fā)酵液中可積累共軛亞油酸最高可達(dá)11.61 mg/L[9].

本實(shí)驗(yàn)采用紫外分光光度法[10-12]，從13株實(shí)驗(yàn)室保存的乳酸菌中篩選具有轉(zhuǎn)化LA生成CLA能力的菌株，并對(duì)其中高產(chǎn)菌株進(jìn)行鑒定. 實(shí)驗(yàn)中所用培養(yǎng)基為小麥胚芽粉培養(yǎng)基，小麥胚芽中脂肪含量約為10%～12%，其中80% 以上是不飽和脂肪酸，亞油酸的含量達(dá)到60% 以上[13]，所以乳酸菌可以利用小麥胚芽中天然存在的亞油酸為底物，而不需要再另外添加底物.

1 材料與方法

1.1 菌種

13株源自本實(shí)驗(yàn)室菌種保藏中心保藏的乳酸菌發(fā)酵劑.

1.2 主要試劑

共軛亞油酸標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99%)購自NU-CHEK-PREP公司；

小麥胚芽粉：德州巨嘴鳥工貿(mào)有限公司；

引物27f、1492r為北京華大中生科技發(fā)展有限公司合成.

1.3 主要儀器

R-201型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海申勝生物技術(shù)有限公司；JY92-Ⅱ型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；CRG型高速冷凍離心機(jī)，日本HITACHI公司；UV2550型紫外可見分光光度計(jì)，日本島津公司；LS-B35L-Ⅲ型立式壓力蒸汽滅菌鍋，江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司；BX51TF型電子顯微鏡，日本OLYMPUS公司.

1.4 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基[14].

小麥胚芽粉培養(yǎng)基：5 g超微粉碎的小麥胚芽粉和1.5 g葡萄糖溶解在75 mL蒸餾水中，攪拌均勻. 超聲細(xì)胞破碎儀乳化5 min，然后高壓蒸汽滅菌30 min.

注：小麥胚芽粉中的蛋白質(zhì)高溫下易變性，故采用高溫蒸汽滅菌.

生理生化試驗(yàn)培養(yǎng)基的配制參照文獻(xiàn)[15].

1.5 菌株活化和發(fā)酵方法

將菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 120 r/min活化24 h，挑取菌液做革蘭氏染色、鏡檢，確定純后，接種于MRS液體培養(yǎng)基中活化2代.

將活化好的菌株以體積分?jǐn)?shù)5%的接種量接入小麥胚芽粉培養(yǎng)基中，37 ℃ 120 r/min培養(yǎng)24 h， 取發(fā)酵液供檢測用.

1.6 樣品預(yù)處理

1.6.1脂肪酸的提取

取發(fā)酵液2 mL加入體積比為氯仿∶甲醇=2∶1的溶劑5 mL，漩渦震蕩后靜置30 min，4 ℃條件下6 000 r/min離心10 min，用移液槍取出下層有機(jī)相.

1.6.2脂肪酸甲酯的制備

脂肪酸甲酯的制備采用酸堿結(jié)合法，提取的脂肪酸溶液中加入2 mL氫氧化鉀-甲醇(0.5 mol/L)溶液，混合均勻，65 ℃水浴加熱30 min，冷卻至室溫. 再加入2 mL鹽酸-甲醇溶液(體積分?jǐn)?shù)為10%)，70 ℃水浴5 min. 反應(yīng)結(jié)束后加入5 mL正己烷，震蕩后靜置，收集有機(jī)層于-20 ℃保存供檢測用.

1.7 CLA紫外吸收標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

稱取2.2 mg CLA標(biāo)準(zhǔn)樣品溶解于1 mL甲醇中，按照1.6.2的方法進(jìn)行甲酯化. 以正己烷為參比，在紫外區(qū)200～260 nm對(duì)CLA標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行掃描，以此來確定CLA的最大吸收波長.

將CLA甲酯分別用正己烷稀釋到不同質(zhì)量濃度(1.1～44.0 mg/L). 以正己烷為參比，在CLA最大吸收波長處，用紫外可見分光光度計(jì)測定不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度. 以CLA濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制CLA標(biāo)準(zhǔn)曲線.

1.8 菌株鑒定

1.8.1菌株菌落、菌體形態(tài)學(xué)特征鑒定

將篩選出的菌株劃線接種于MRS固體平板培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)48 h，觀察其菌落特征、菌體形態(tài)和革蘭氏染色特征.

1.8.2菌株生理生化特征鑒定

參照《乳酸細(xì)菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》[14]，對(duì)篩選出的菌株進(jìn)行屬性歸類.

1.8.316SrDNA 鑒定

采用改進(jìn)的CTAB法[16]提取篩選菌株基因組DNA，以通用引物27f 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492r 5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′擴(kuò)增其16SrDNA 片段，序列測序后提交到GenBank. 將篩選菌株的16SrDNA 序列進(jìn)行BLAST檢索比對(duì)，對(duì)菌株進(jìn)行同源性分析. 然后從GenBank等數(shù)據(jù)庫中篩選相關(guān)模式菌株的16SrRNA序列，將篩選菌株序列與模式菌株序列一起經(jīng)ClustalX1.83軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，利用軟件MEGA3.1構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹.

1.9 數(shù)據(jù)分析

所有檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行3次獨(dú)立的平行實(shí)驗(yàn)，計(jì)算均值.

2 結(jié)果與分析

2.1 CLA紫外吸收標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析結(jié)果

在紫外區(qū)200～260 nm對(duì)CLA標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行掃描，掃描結(jié)果如圖1，CLA的最大吸收波長是233 nm[10-12].

圖1 CLA標(biāo)準(zhǔn)品紫外掃描圖譜Fig.1 Wavelength scan curve of CLA standard

在233 nm處測定CLA標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度，標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制如圖2，其線性回歸方程為：y=0.073 8x-0.001 1，擬合度R2=0.995 8，CLA濃度范圍為1.1～44.0 mg/L.

圖2 CLA標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of CLA absorbance at 233 nm

2.2 菌株產(chǎn)CLA 水平的篩選

采用UV的方法對(duì)13株菌小麥胚芽粉發(fā)酵液中CLA的含量進(jìn)行測定，將測得的吸光度值代入回歸方程y=0.073 8x-0.001 1，求出x再乘以稀釋倍數(shù)即是樣品中CLA的濃度，結(jié)果如圖3. 篩選出8株具有產(chǎn)CLA能力的菌株，其中As1.2686的產(chǎn)量最高，為13.63 mg/L；其次是B11693，產(chǎn)量為11.55 mg/L.

As1.2686已知是嗜酸乳桿菌，故對(duì)B11693進(jìn)行菌種鑒定.

圖3 乳酸菌發(fā)酵液中CLA的生成量Fig.3 Concentration of CLA produced by lactic acid bacteria

2.3 菌株B11693的菌落和形態(tài)特征分析

菌株B11693在固體平板培養(yǎng)基上，菌落形態(tài)不規(guī)則，低凸起，邊緣波狀，半透明，菌落為乳白色. 在1000倍光學(xué)顯微鏡下觀察，菌體細(xì)胞呈桿狀，革蘭氏染色陽性，菌體短而直，兩端圓，單個(gè)或成短鏈排列，如圖4.

圖4 菌株B11693菌體形態(tài)特征Fig.4 Cell characteristics of B11693 strain

2.4 菌株B11693的生理生化特性分析

對(duì)待鑒定菌株B11693進(jìn)行葡萄糖、乳糖、蔗糖等12種糖類的發(fā)酵試驗(yàn)，并對(duì)其進(jìn)行了過氧化氫酶、明膠液化等試驗(yàn)，結(jié)果見表1和表2.

表1 菌株B11693的糖發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Results of carbohydrate fermentation test of B11693 strain

表2 菌株B11693的生化試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of biochemistry test of B11693 strain

由表1糖發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果可見菌株B11693能發(fā)酵大部分糖類，但不能發(fā)酵甘露糖、山梨醇、鼠李糖. 由表2可知，該菌過氧化氫酶陰性，硝酸鹽還原試驗(yàn)陰性，不液化明膠，不產(chǎn)生硫化氫，只有石蕊牛乳試驗(yàn)成陽性反應(yīng).

由形態(tài)學(xué)及生理生化試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)照文獻(xiàn)[14]對(duì)菌株B11693進(jìn)行屬性歸類，可確定菌株B11693屬于乳酸桿菌屬.

2.5 菌株B11693的16SrDNA 序列分析

提取DNA后PCR擴(kuò)增菌株B11693的16SrDNA序列，通過瓊脂糖電泳查看結(jié)果，如圖5. 擴(kuò)增結(jié)果為單一條帶，其大小約1 500 bp.

圖5 菌株B11693的16SrDNA片段PCR擴(kuò)增圖Fig.5 PCR amplification of the 16SrDNA of strain B11693

測序結(jié)果表明， 該序列長度為1 450 bp，序列提交到GenBank登記，登陸號(hào)為EU744192. 與GenBank數(shù)據(jù)庫的序列作比對(duì)，進(jìn)行同源性分析，結(jié)果見表3. 由表3可以看出，菌株B11693與短乳桿菌(Lactobacillus brevis)的同源性最高，相似性達(dá)99%. 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖6所示，表明菌株B11693與短乳桿菌(Lactobacillus brevis)親緣關(guān)系最近，與短乳桿菌(EU194349)可信度的百分比數(shù)值為95. 因此結(jié)合以上形態(tài)學(xué)及生理生化試驗(yàn)結(jié)果鑒定菌株B11693為短乳桿菌.

表3 菌株B11693的16SrDNA同源性比較Tab.3 Comparison of the identify between B11693 strain and 16SrDNA

圖6 菌株B11693的16SrDNA全序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic tree of B11693 strain based on 16SrDNA full-length sequence

3 結(jié) 論

從本實(shí)驗(yàn)室菌種保藏中心保藏的13株乳酸菌發(fā)酵劑中初篩出8株具有產(chǎn)CLA能力的菌株，其中As1.2686和B11693的產(chǎn)量較高，發(fā)酵液中CLA含量分別為13.63 mg/L和11.55 mg/L，選擇菌株B11693做進(jìn)一步的鑒定.

通過菌株菌落、菌體形態(tài)學(xué)特征和生理生化特征的鑒定，對(duì)照文獻(xiàn)[14]對(duì)菌株B11693進(jìn)行屬性歸類，可確定該菌屬于乳酸桿菌屬. 通過16SrDNA的分子生物學(xué)的鑒定方法對(duì)細(xì)菌基因序列進(jìn)行分析. 測序結(jié)果表明菌株序列長度為1450bp，序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫做序列比對(duì)，進(jìn)行同源性分析；然后從GenBank等數(shù)據(jù)庫中篩選相關(guān)模式菌株的16SrDNA序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，表明該菌株與短乳桿菌(Lactobacillus brevis)親緣關(guān)系最近，菌株B11693與短乳桿菌(EU194349)可信度的百分比數(shù)值為95，鑒定為短乳桿菌.

短乳桿菌是乳酸菌中乳桿菌屬的重要菌種. 研究表明，短乳桿菌具有高產(chǎn)酸能力和解毒、抑菌，提高機(jī)體免疫能力等多種功能特性，已被逐漸應(yīng)用于食品和醫(yī)藥生產(chǎn)中，但是關(guān)于短乳桿菌轉(zhuǎn)化LA生成CLA的報(bào)道很少. 本研究初篩出的CLA產(chǎn)量只有11.55 mg/L，有待進(jìn)一步優(yōu)化產(chǎn)CLA的條件，來提高短乳桿菌B11693產(chǎn)CLA的能力.