曲華偉,張陽德,陳玉祥,趙勁風,王吉偉,何剪太

原發(fā)性肝癌是世界上最常見且惡性程度最高的腫瘤之一, 發(fā)病率在惡性腫瘤中位居世界第 5位,病死率位居第 3位[1]。傳統(tǒng)的手術(shù)治療、放療、化療等都不能對其徹底治愈。因此,研究探索新療法具有重要意義。近年來,隨著近紅外激光技術(shù)的研究進展,在近紅外激光水平上開展腫瘤熱療引起了人們的廣泛興趣。本研究通過觀察近紅外激光 (808 nm)誘導產(chǎn)熱對肝癌進行體內(nèi)、體外的實驗研究,旨在為開辟新的有效的肝癌治療途徑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞株及實驗動物 人肝癌 HepG2細胞,由中南大學湘雅醫(yī)院衛(wèi)生部肝膽腸外科研究中心傳代培養(yǎng)。BALB/N裸鼠 56只,4～6周齡,22～25 g,雄性,飼養(yǎng)于中南大學動物學部層流動物房。

1.2 方法 體外實驗:(1)人肝癌 HepG2細胞貼壁生長48 h,熱療組分別按激光功率 1、2、3、4 W各照射 10 min,對照組 Hep G2細胞未照射,繼續(xù)培養(yǎng) 24 h,然后用苔盼藍染色后于倒置顯微鏡下拍照;(2)細胞接種于 96孔培養(yǎng)板中,培養(yǎng) 48 h后分別按不同功率近紅外激光 (1、2、3、4 W)照射 10 min,繼續(xù)培養(yǎng),進行 MTT實驗;(3)腫瘤細胞傳代后制成單細胞懸液,接種于 24孔培養(yǎng)板中,并設(shè)對照組,近紅外激光按不同功率 (1、2、3、4 W)分別照射 10 min,24 h后收集細胞,接種于 96孔培養(yǎng)板中,每 24 h計算細胞數(shù)量,連續(xù) 4次。

體內(nèi)實驗:將 30只移植性人肝癌裸鼠按隨機數(shù)字表法分為對照組和熱療組,熱療組又分為 1 W照射組、2 W照射組、3 W照射組和 4 W照射組,每組6只。各熱療組裸鼠分別給予不同功率近紅外激光照射10 min,每3 d照射 1次,觀察腫瘤的生長情況。8周后治療結(jié)束,處死裸鼠,剝離瘤體,觀察腫瘤體積變化。用蘇木素 -伊紅染色觀察對照組與各熱療組裸鼠移植瘤組織的病理變化。

1.3 觀察指標 體外實驗:激光熱療后細胞形態(tài)變化;MTT檢測激光對細胞增殖的影響;細胞計數(shù)觀察激光熱療對細胞數(shù)量的影響。體內(nèi)實驗:觀察熱療后裸鼠移植瘤體積變化及其組織病理學改變。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用 SPSS 10.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計分析。計量資料用 (x±s)表示,采用方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 人肝癌 Hep G2細胞體外實驗結(jié)果

2.1.1 近紅外激光熱療對肝癌 HepG2細胞形態(tài)的影響 對照組細胞形態(tài)規(guī)則,未見明顯細胞破裂及碎片 (見圖 1A)。熱療組細胞變形、壞死,細胞碎片逐漸增多,細胞貼壁減少(見圖 1B)。觀察近紅外激光照射區(qū)與非照射區(qū)可發(fā)現(xiàn),右下方的照射區(qū)內(nèi)細胞變形,碎片增多,貼壁減少,細胞壁損傷,苔盼藍染色;而左上方的非照射區(qū)細胞形態(tài)正常,貼壁良好,未被苔盼藍染色 (見圖1C)。近紅外激光照射范圍內(nèi)細胞壞死明顯,范圍外細胞正常。兩者界限明顯,顯示近紅外激光具有顯著的選擇性 (見圖1D)。

2.1.2 近紅外激光熱療對肝癌 HepG2細胞增殖的影響 近紅外激光熱療對肝癌 Hep G2細胞增殖有顯著的抑制作用。且隨著激光熱療功率的增加,細胞抑制率也增加 (P＜0.05,見表1)。

2.1.3 近紅外激光熱療對肝癌 HepG2細胞生長抑制的影響不同功率近紅外激光誘導下,肝癌細胞株細胞生長數(shù)量較對照組顯著降低,差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05,見表 2)。

2.2 近紅外激光熱療對肝癌裸鼠體內(nèi)實驗結(jié)果

2.2.1 近紅外激光熱療對肝癌裸鼠腫瘤體積的影響 近紅外激光熱療組裸鼠移植瘤體積縮小,瘤體表面不光滑,可見壞死及焦痂形成。對照組移植瘤體積逐漸增大,表面光滑 (見圖2)。各熱療組裸鼠腫瘤體積與對照組比較,差異均有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05,見表 3)。

2.2.2 肝癌裸鼠移植瘤組織近紅外激光照射前后組織病理變化 對照組腫瘤細胞生長良好,細胞分裂相多見。而熱療組裸鼠組織均出現(xiàn)不同程度的腫瘤壞死,壞死面積明顯高于對照組(見圖 3)。

表 1 不同功率近紅外激光熱療對 HepG2細胞作用的 MTT結(jié)果 (x±s)Table 1 MTT of thermal ablation with near-infrared laser of HepG2 cells

表 2 不同功率近紅外激光作用HepG2細胞不同時間時細胞生長數(shù)量(x±s,1×104)Table 2 Number of HepG2 cell by thermal ablation with near-infrared laser of cells

表 3 不同功率近紅外激光熱療對裸鼠腫瘤體積的抑制作用Table 3 Volumeinhibition of tumor after thermal ablation with near-infrared laser

圖 2 裸鼠成瘤及激光照射腫瘤變化Figure 2 Tumor by thermal ablation with near-infrared laser

圖 1 近紅外激光熱療對肝癌 HepG2細胞形態(tài)的影響Figur e 1 Effect of HepG2 cells change before and after thermal ablation with near-infrared laser

圖 3 裸鼠成瘤激光照射前后的組織病理變化Figur e 3 Pathology change of tumor tissue beforeand after thermal ablation with near-infrared laser

3 討論

原發(fā)性肝癌是世界上最常見且惡性程度最高的腫瘤之一,發(fā)病率在惡性腫瘤中位居世界第 5位,病死率位居第 3位。目前,肝癌治療首選手術(shù)切除。由于我國肝癌大部分伴有肝硬化或慢性肝炎,按大范圍的規(guī)則肝切除可導致并發(fā)癥的發(fā)生率及病死率增加[2]。而局部小范圍切除雖可以降低病死率,但往往導致腫瘤切除不徹底,術(shù)后復發(fā)率升高。而對于不能手術(shù)的肝癌患者目前較為常用的有聚焦超聲[3]、射頻[4]、微波、冷凍[5]等通過改變瘤內(nèi)溫度而殺死腫瘤的方法。這些方法的共同點就是在肝臟內(nèi)部形成一個規(guī)則的壞死區(qū)域,從而達到使腫瘤壞死的目的。以上治療方式都具有治療范圍外形規(guī)則的特點,當腫瘤臨近肝門區(qū)或下腔靜脈等重要器官時,治療顯得較為棘手,為降低手術(shù)風險往往避開這些區(qū)域,從而導致腫瘤切除不徹底,術(shù)后復發(fā)率升高。

本研究采用近紅外激光熱療治療肝癌的方法與以上治療方式不同。近紅外激光熱療的原理是利用激光產(chǎn)生熱效應和腫瘤不耐熱的特點對腫瘤進行治療,導致腫瘤凝固壞死,以達到滅活腫瘤和減少瘤負荷的目的[6]。近紅外激光照射可以根據(jù)腫瘤形狀的不同改變照射范圍,從而達到選擇性熱療的效果。正如圖 1C與圖 1D中所見,根據(jù)激光照射范圍的不同,壞死細胞與正常細胞之間界限明顯?？梢?近紅外激光熱療具有選擇性特點。該治療方法選擇性較好,尤適用于那些腫瘤外形不規(guī)則,或臨近肝門區(qū)或下腔靜脈等重要器官的患者,從而徹底殺死腫瘤,降低術(shù)后復發(fā)率。

近年來,隨著納米技術(shù)的發(fā)展,在納米水平上研制納米磁性載體和藥物又引起了人們的廣泛關(guān)注。顏士巖等[7]研究的Fe2O3納米磁流體熱療治療肝癌就獲得了不錯的效果。但該研究也存在某些不足。首先,納米磁流體熱療溫度較低,最高至54℃,僅限于較低溫度誘導腫瘤的凋亡,并不能直接殺死腫瘤,也就不能達到根治的目的;其次,由于磁流體熱療溫度較低,其持續(xù)加熱時間較長 (60～90 min),高頻交變磁場照射的時間也就增加,對正常組織是否有毒副作用尚有待探討。本研究采用的選擇性近紅外激光熱療可直接殺死腫瘤組織。由于溫度較高,激光照射時間較短,對正常組織損害較小,是一種較為理想的選擇性熱療方式。本研究體外實驗結(jié)果顯示,經(jīng)近紅外激光照射后,肝癌 HepG2細胞變性、壞死,且照射區(qū)壞死細胞與非照射區(qū)正常細胞界限明顯,說明近紅外激光有顯著的選擇性。經(jīng)過近紅外激光照射后,Hep G2細胞增殖和細胞生長明顯受抑制,且激光功率越高,抑制率也越高。體內(nèi)實驗結(jié)果顯示,近紅外激光照射后,肝癌裸鼠腫瘤體積較未照射的肝癌裸鼠顯著縮小,且激光功率越高,腫瘤體積抑制率也越高。

目前關(guān)于近紅外激光熱療治療腫瘤的研究國內(nèi)尚未見報道。我們利用選擇性近紅外激光誘導產(chǎn)熱的特點,將其應用到腫瘤治療中,進行了一系列的體內(nèi)體外實驗,為今后近紅外激光熱療應用于臨床積累了一定的實驗數(shù)據(jù),初步驗證了該治療方法的可行性和有效性。

1 葉家才,崔書中,巴明臣.原發(fā)性肝癌的流行病學特征及其危險因素 [J].實用醫(yī)學雜志,2008,24(10):1839-1841.

2 張清華,劉景豐 .原發(fā)性肝癌治療進展 [J].醫(yī)學綜述,2008,14(10):1479-1481.

3 白晉,李發(fā)琪,杜永洪.高強度聚焦超聲形成生物學焦域的劑量學研究 [J].第三軍醫(yī)大學學報,2004,26(15):1378-1380.

4 張隆群,王濟明.射頻消融與手術(shù)切除治療肝癌并發(fā)癥及生存率的臨床對照研究 [J].第三軍醫(yī)大學學報,2007,29(5):457-459.

5 周霖,楊永平,劉靜.氬氦刀冷凍治療早期肝癌療效分析 [J].胃腸病學和肝病學雜志,2008,17(12):1000-1002.

6 Muralidharan V,Christophi C.Interstitial laser thermotherapy in the treatment of colorectal liver metastases[J].J Surg Oncol,2001,76(1):73-81.

7 顏士巖,張東生,鄭杰.Fe2O3納米磁流體熱療治療肝癌 [J].中華實驗外科雜志,2004,21(12):1443-1446.