薛 茜,鄒玉安,趙寶民,楊向方

腦缺血再灌注損傷導致的遲發(fā)性神經(jīng)元損傷,主要與氧化應激反應、炎癥反應及細胞凋亡等有關(guān)?？的X液 1號為臨床治療缺血性腦血管病的經(jīng)驗組方,臨床療效良好。藥理研究證實康腦液 1號組方中單藥如黃芪、三七、葛根等具有擴張血管、改善腦血流及微循環(huán)、降低血液黏度及血脂、抑制炎性反應等作用[1-4]。神經(jīng)元凋亡是一種受基因調(diào)控的自主性、程序性細胞死亡過程,是腦缺血再灌注損傷的重要環(huán)節(jié)。Bcl-2/Bax比值與細胞凋亡調(diào)控有關(guān)。本研究通過觀察康腦液 1號對局灶性腦缺血再灌注后缺血半暗帶神經(jīng)元凋亡和 Bcl-2/Bax比值的影響,探討其可能的腦保護作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 健康雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠180只,體質(zhì)量 (270±20)g,SPF/UAF級,購自北京大學醫(yī)學部實驗動物科學部,許可證號:SCXK(京)2006-0008。稱重后隨機將大鼠分成 5組,每組 36只。 (1)假手術(shù)組;(2)模型組 (缺血再灌注組);(3)鹽酸法舒地爾注射液組;(4)康腦液 1號 A組;(5)康腦液 1號 B組。

1.2 藥物與試劑 康腦液 1號,由黃芪、三七等 8味中藥組成,由河北北方學院第一附屬醫(yī)院中藥房煎制。常規(guī)煎煮并濃縮至 4 g/ml。鹽酸法舒地爾注射液 (川威):天津紅日藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn) (國藥準字 H20040356;產(chǎn)品批號:060608;規(guī)格 2 ml:30 mg)。栓線購自北京沙東生物技術(shù)有限公司〔產(chǎn)品編號2432-100,線長40 mm,線身直徑 0.24 mm,頭端直徑 (0.32±0.02)mm〕。凋亡試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司 (產(chǎn)品批號:10090522)。

1.3 方法

1.3.1 動物模型制備 康腦液 1號采用灌胃法,鹽酸法舒地爾注射液采用腹腔注射,均連續(xù)給藥 7 d,每天早晨給藥 1次,最后 1次給藥 1 h后實施腦缺血再灌注手術(shù),術(shù)后繼續(xù)給藥至再灌注各時間點 (12、24、72 h);給藥劑量按大鼠與人體表面積等效劑量折算,康腦液 1號 A組劑量為 1.5 g·100 g-1·d-1,B組劑量為 3.0 g·100 g-1·d-1。假手術(shù)組和模型組大鼠自手術(shù)日前 7天開始給予等量去離子水灌胃。采用改良 Longa法[5]復制大鼠大腦中動脈栓塞模型 (MCAO),大鼠用 7%水合氯醛 (350 mg/kg)腹腔注射麻醉,仰臥固定于大鼠解剖板上;剪去頸右前部手術(shù)區(qū)的毛,碘酒消毒,鋪洞巾,于頸部行 15 mm旁正中縱行切口,并鈍性分離右側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)動脈及頸外動脈;用無損傷動脈夾夾閉頸總動脈近心端后,頸外動脈遠端結(jié)扎,靠近頸內(nèi)、外分叉處約 5 mm剪一小切口,迅速將栓線插入頸內(nèi)動脈直至有輕微阻力感為止,模型組、鹽酸法舒地爾組及康腦液1號 A、B組栓線插入深度為 (20.0±0.5)mm;假手術(shù)組麻醉同上,頸部切口暴露頸外動脈,不插線。實現(xiàn)大腦中動脈阻塞而致腦缺血;固定栓線去除動脈夾,栓線外留約 5 mm,逐層縫合;2 h后提拉栓線頭端退回至頸外動脈內(nèi),實現(xiàn)大腦中動脈再灌注,造模完成。動物清醒后觀察各組的活動度并采用 Longa評分標準進行神經(jīng)功能評分 (0分:無神經(jīng)功能缺損表現(xiàn);1分:對側(cè)前爪不能充分伸展;2分:行走時向外側(cè)轉(zhuǎn)圈;3分:行走時向?qū)?cè)傾斜;4分:不能行走,意識喪失),1～3分者納入實驗,不符合模型判斷標準的動物剔除。假手術(shù)組未腦缺血,評分均為 0分;模型組、鹽酸法舒地爾組及康腦液 1號 A、B組手術(shù)均成功,均符合模型判斷標準,納入評分。

1.3.2 TTC染色及腦梗死體積測定 缺血 2 h再灌注24 h后,每組隨機抽取 6只大鼠,快速斷頭取出鼠腦,置冰箱(-20℃)內(nèi) 10 min后,切除嗅腦,取冠狀面從前向后均勻切成 2 mm厚腦片 5～6片,將切片迅速置于 2%TTC溶液 (37℃水浴)中避光條件下染色 30 min。正常腦組織染成紅色,缺血區(qū)呈灰白色,界線清晰。4%多聚甲醛固定 24 h。數(shù)碼相機攝片,計算機圖像分析,求得 TTC染色兩側(cè)正常區(qū)與梗死灶的面積。以缺血對側(cè)腦片的面積減去缺血側(cè) TTC染色正常區(qū)的面積求得腦梗死面積。

1.3.3 HE染色觀察病理形態(tài) 將實驗大鼠缺血 2 h,至再灌注所需時間點時,用 7%水合氯醛腹腔注射麻醉,常規(guī)灌注4%多聚甲醛 200 ml固定30 min?？焖贁囝^取腦,從前向后將腦組織分為 A、B、C、D、E 5等分,切成 2～3 mm厚的腦片,選取 C腦片,入 4%多聚甲醛固定液中繼續(xù)固定 24 h。常規(guī)乙醇脫水、二甲苯透明,石蠟包埋,切片厚度 5μm,4℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 腦神經(jīng)元凋亡檢測 采用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(Td T)介導的地高辛 d UTP缺口末端標記法 (TUNEL)來識別凋亡細胞。

1.3.5 Bcl-2/Bax比值測定 采用 SP法進行檢測,陰性對照用 0.01 mol/L PBS(p H 7.4)代替一抗。嚴格按說明書進行操作,DAB顯色,常規(guī)脫水、透明、封片?？贵w及試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司 (PV-6001,批號:K92708D)?？贵w稀釋液:ZL1-9029,批號:546892A。

1.4 統(tǒng)計學方法 所有數(shù)據(jù)以 (x±s)表示,采用 SPSS 16.0軟件包進行統(tǒng)計學處理。多組間均值的比較采用單因素方差分析,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)行為學評分及腦梗死體積 大鼠 MCAO術(shù)后多于1.5 h內(nèi)清醒。假手術(shù)組大鼠活動度大。模型組大鼠術(shù)后精神較差,反應遲鈍,蜷縮扎堆,24 h后仍然有蜷縮扎堆現(xiàn)象?？的X液 1號組和鹽酸法舒地爾組的大鼠狀態(tài)有一定好轉(zhuǎn),活動度較大,無蜷縮扎堆現(xiàn)象。術(shù)后 24 h康腦液 1號組和鹽酸法舒地爾組 Longa評分低于模型組,差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.01,見表1)。缺血再灌注6 h即可看到明顯梗死灶,累及右側(cè)大腦半球基底核區(qū)、額頂葉皮質(zhì)及海馬區(qū),隨再灌流時間的延長梗死面積逐漸增大,至缺血再灌注 24 h時,模型組梗死面積為 (43.00±0.68)%,康腦液 1號 A、B組分別為(35.20±0.55)%、(35.00±0.37)%?？的X液 1號 A、B組與模型組相比梗死面積明顯減小,差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05)。

表 1 各組大鼠神經(jīng)功能行為學評分比較 (x±s,分)Table 1 Comparison of the neuralogical function score

2.2 組織病理學改變 高倍光鏡下觀察。(1)假手術(shù)組:大腦組織結(jié)構(gòu)完整,無梗死灶及水腫。神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細胞未見異常。細胞膜、核膜清晰,核仁明顯。 (2)模型組:缺血第 1天,缺血對側(cè),細胞形態(tài)正常,核仁清楚。缺血側(cè)皮質(zhì)神經(jīng)元數(shù)量明顯減少,排列紊亂,組織間隙水腫嚴重。缺血半暗帶明顯,神經(jīng)元稍小,形態(tài)基本正常;缺血灶中心區(qū)神經(jīng)元體積明顯縮小,部分細胞呈三角形,膠質(zhì)細胞固縮。缺血第 7～14天神經(jīng)元、膠質(zhì)細胞、毛細血管、小血管與周圍腦間質(zhì)的間隙顯著增大,間質(zhì)疏松。病灶中心區(qū)隨時間延長出現(xiàn)大量液化性壞死灶及囊性變,后期呈網(wǎng)狀改變,殘存細胞很少。(3)康腦液 1號 A組和 B組及鹽酸法舒地爾組:在各個時間點與模型組相比,神經(jīng)元形態(tài)改變較輕,細胞體完整,突起較清楚,基本保持完整。可見尚存的大腦皮質(zhì)的正常神經(jīng)元排列結(jié)構(gòu),且組織間隙水腫較模型組明顯減輕,神經(jīng)元、膠質(zhì)細胞和血管大量變性壞死等缺血性改變和炎性反應明顯輕于模型組。

2.3 康腦液 1號對大鼠腦缺血半暗帶神經(jīng)元凋亡及 Bax/Bcl-2比值的影響 光鏡下 (×400)細胞核內(nèi)存在棕黃色顆粒者為凋亡細胞。在梗死周邊區(qū)隨機選取 10個互不重疊視野,計數(shù)陽性細胞數(shù)。各時間點模型組細胞凋亡數(shù)及 Bcl-2/Bax比值明顯高于假手術(shù)組 (P＜0.05);與模型組比較,康腦液 1號 A組和 B組、鹽酸法舒地爾組細胞凋亡數(shù)目減少 (P＜0.05),而 Bcl-2/Bax比值升高 (P＜0.05,見表 2、3)。

表 2 各組大鼠缺血半暗帶神經(jīng)元凋亡數(shù)目比較 (x±s)Table 2 Comparison of the numbers of the neuronal apoptosis cells around the necrotic area in rats

表 3 康腦液 1號對缺血再灌注大鼠缺血半暗帶 Bcl-2/Bax比值的影響(x±s)Table 3 The effectsof kangnao ye 1 on the Bcl-2/Bax ratio after the focal cerebral ischemia-reperfusion around the necrotic area in rats

3 討論

近年來,關(guān)于中藥復方治療腦卒中的研究進展迅速。康腦液 1號中黃芪為君藥,三七、葛根、天麻、川芎共為臣藥,佐以鉤藤、地龍,同時川芎、地龍又具引藥之性,二藥輕清引上,直達病所。黃芪益氣升陽,三七活血止血[6],鉤藤熄風鎮(zhèn)驚,地龍清熱利濕,天麻、川芎定風[7]。對腦缺血損傷的神經(jīng)保護作用的機制可能為多水平、多通道、多靶點的綜合效應。

研究表明,缺血半暗帶的細胞凋亡與疾病轉(zhuǎn)歸相關(guān)。細胞凋亡是細胞為維持其內(nèi)穩(wěn)態(tài)的自主程序性死亡 (programmed cell death,PCD)。抑制缺血后神經(jīng)元凋亡對保護神經(jīng)元具有重要意義。細胞凋亡的機制與凋亡基因表達有關(guān),即促凋亡基因和抗凋亡基因。Bcl-2、Bax基因是目前研究較明確的一對在功能上相互對立的凋亡調(diào)控基因。

Bcl-2蛋白家族是細胞凋亡調(diào)控蛋白,主要分布于線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細胞核的外膜[8]。Bcl-2蛋白家族根據(jù)其作用分為 2類:一類為抗凋亡蛋白,如 Bcl-2蛋白;另一類為促凋亡蛋白,如 Bax蛋白?？沟蛲龅鞍缀痛俚蛲龅鞍字g相互拮抗。Bcl-2蛋白能夠抑制 Bax蛋白啟動凋亡機制。而 Bax蛋白作為 Bcl-2蛋白家族的促凋亡成員,可以不依賴于激活或抑制其他相關(guān)基因而誘導細胞凋亡。細胞是否進入凋亡程序決定于 Bcl-2蛋白和 Bax蛋白的相對值,Bcl-2/Bax的比值改變與神經(jīng)元凋亡密切相關(guān)[9]。

以往研究顯示腦缺血后促凋亡蛋白 Bax表達明顯增加,且Bax陽性反應位于 TUNEL陽性的細胞內(nèi),其時程與空間的分布與 TUNEL陽性神經(jīng)元一致[10]。Bcl-2/Bax比值的改變可能調(diào)控了神經(jīng)元的凋亡。研究表明,細胞受刺激后 Bcl-2/Bax比值越高,細胞存活率越高,細胞凋亡率越低。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)缺血再灌注后大鼠神經(jīng)元凋亡數(shù)目、Bcl-2/bax比值均明顯高于假手術(shù)組;Rho激酶抑制劑鹽酸法舒地爾注射液對腦缺血再灌注具有很好的改善作用[11-12],可降低凋亡率,升高 Bcl-2/Bax比值。本研究顯示,康腦液 1號A組和 B組可上調(diào)腦缺血再灌注誘導的 Bcl-2蛋白表達,同時下調(diào) Bax蛋白表達,使 Bcl-2/Bax比值升高,可能促使 Bax-Bcl-2異源二聚體形成,抑制細胞凋亡。康腦液 1號 A組和 B組不同劑量給藥對大鼠神經(jīng)元凋亡數(shù)目、Bcl-2/bax比值的影響無顯著性差異,符合臨床中醫(yī)中藥辨證論治理論。中藥組方中各單味中藥之間的比例是關(guān)鍵,而中藥組方的總劑量對治療無決定性作用。經(jīng)康腦液 1號治療后,梗死灶明顯減小,腦神經(jīng)元凋亡減少,Bcl-2/Bax比值明顯高于缺血再灌注組,說明康腦液 1號可能通過抑制腦神經(jīng)元凋亡,達到保護缺血半暗帶目的,從而起到保護大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的作用。

綜上所述,康腦液 1號可明顯減少 MCAO大鼠缺血半暗帶神經(jīng)元凋亡,其機制可能與提高 Bcl-2/Bax比值有關(guān),這可能是其促進神經(jīng)元修復及重塑的機制之一。為臨床應用康腦液 1號治療缺血性腦血管疾病提供了一定的實驗依據(jù)。

1 李花,鄧常清,陳北陽,等 .三七總皂苷對大鼠腦缺血再灌注后Caspase表達的影響 [J].中國藥理學通報,2006,22(2):189-193.

2 何蔚,朱遵平.三七總皂苷對大鼠腦梗死區(qū) ICAM-1表達和中性粒細胞浸潤的影響 [J].中藥材,2005,28(5):403-405.

3 孟秀君,宋禾,康志偉 .急性腦梗死患者血清基質(zhì)金屬蛋白酶 -9水平的變化及三七皂苷對其的影響 [J].中國全科醫(yī)學,2007,11(5):738.

4 孫衛(wèi),鄭學芝,崔榮軍,等 .葛根素對 2型糖尿病大鼠脂代謝及脂肪分化相關(guān)蛋白基因表達的影響 [J].中國全科醫(yī)學,2007,11(7):1161.

5 Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke,1989,20(1):84-91.

6 劉宗超,吳官恩,趙克建,等.三七三醇皂苷對大鼠缺血/再灌注腦損傷保護作用的實驗研究 [J].中風與神經(jīng)疾病雜志,2007,24(1):38-40.

7 毛宇飛,王曉楊,王萬鐵,等 .肺缺血 -再灌注損傷超微結(jié)構(gòu)及川芎嗪對其影響 [J].中國全科醫(yī)學,2007,10(16):1337.

8 金華,孫抒,于柏艷,等.蠐螬提取物對 MCF-7人乳腺癌細胞株凋亡的影響 [J].中國病理生理雜志,2008,24(1):93-96.

9 Oltvai ZN,Milliman CL,Korsmeyer SJ.Bcl-2 heterodinerizes in vivo with a conserved homolog,Bax,that accelerates programmed cell death[J].Cell,1993,74(4):609-619.

10 Cao G,Minami M,Pei W,et al.Intracellular Bax translocation after transient cerebral ischemia:implications for a role of the mitochondrial apoptotic signaling pathway in ischemic neuronal death[J].J Cereb Blood Flow Metab,2001,21(4):321.

11 Satoh S,Ikegaki I,Suzuki Y,et al.Neuroprotective properties of a protein kinase inhibitor against ischemia-induced neuronal damage in rats and gerbils[J].Br JPharmacol,1996,118(7):1592.

12 賈婕.氯吡格雷對急性腦梗死患者 C反應蛋白水平的影響 [J].中國誤診學雜志,2008,8(25):6073.