王玉芳 孟凡杰 馮向飛

(濰坊市益都中心醫(yī)院 山東濰坊 262500)

動脈粥樣硬化是慢性炎癥和免疫反應的交互過程[1],HSP和細胞凋亡參與該過程。其中,易損斑塊的破裂是急性冠脈綜合征(ACS)的病理基礎。通過建立兔動脈粥樣硬化易損斑塊模型,研究HSP70和細胞凋亡在兔動脈易損斑塊中的作用,尋找穩(wěn)定斑塊的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

(1)健康純種大白兔32只,1.5～3.0kg,月齡(3.7±1.5)個月,雌雄不限。

(2)試劑與藥品:①兔單克隆抗HSP70抗體:Santa Cruz公司產(chǎn)品。②細胞凋亡試劑盒MK1020:購自武漢博士德公司。③SP免疫組化檢測試劑盒為北京中山公司產(chǎn)品。

1.2 方法

(1)兔動物動脈粥樣硬化斑塊模型的制作由二醫(yī)大實驗動物中心提供并協(xié)助制作動脈粥樣硬化斑塊模型,制備石蠟標本。

(2)病理學檢查:①大體形態(tài):觀察動脈斑塊形成情況;②組織病理:取最大動脈斑塊,經(jīng)固定、包埋后橫切制成3～5μm切片,HE染色,光學顯微鏡觀察。

(3)易損斑塊認定與與分區(qū)切片經(jīng)HE染色,在顯微鏡下觀察,分為4個區(qū):纖維帽區(qū)(斑塊表面)、)脂核區(qū)(斑塊中部),肩部區(qū)(斑塊與正常血管壁交界處)和中膜平滑肌區(qū)(基底部區(qū))。同時根據(jù)細胞及核的形狀、大小及染色情況來區(qū)分不同的細胞,如平滑肌細胞和炎癥細胞。

(4)HSP檢測采用免疫組化技術,SP(鏈霉菌抗生物素蛋白-生物素-過氧化物酶復合物)法。

(5)細胞凋亡檢測采用TUNEL法。即采用末端脫氧核苷酸轉移酶(TdT)介導的dUTP缺口末端標記法。

(6)計算方法:顯微鏡(×400)下觀察,用IPP(Image Pro Plus)圖像分析軟件分別計算各區(qū)中HSP70表達陽性細胞和TUNEL陽性細胞數(shù),分別計算其百分數(shù),取均值代表每一樣本數(shù)。)

表1 兔易損斑塊中HSP70高表達細胞和TUNEL陽性細胞分布情況[(n=28),(±s)]

表1 兔易損斑塊中HSP70高表達細胞和TUNEL陽性細胞分布情況[(n=28),(±s)]

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圖1 肩部區(qū)HSP70的陽性表達情況(×100)

圖2 平滑肌區(qū)細胞凋亡的情況(×200)

2 結果

(1)HSP70在兔動脈易損斑塊中的表達。HSP70在正常細胞胞漿表達呈均勻淡紫色,陽性表達細胞呈深淺不一的棕褐色(圖1)。纖維帽區(qū)平滑肌細胞表現(xiàn)為HSP70高表達,與其余三區(qū)差異均有顯著性(P<0.01,P<0.01,P<0.05)。纖維帽區(qū)和肩部區(qū)炎癥細胞表現(xiàn)為HSP70高表達,與其余二區(qū)均有顯著性差異(P<0.01,P<0.01)(表1,圖1)。

(2)TUNEL法在兔動脈易損斑塊中陽性反應正常細胞核均勻著綠色,凋亡細胞核呈深淺不一的棕黃色(圖2)。脂核區(qū)平滑肌細胞中TUNEL陽性細胞百分數(shù)增高,與其余三區(qū)均有顯著性差異(P<0.01,P<0.01,P<0.01)。脂核區(qū)炎癥細胞中TUNEL陽性細胞百分數(shù)增高,與其余三區(qū)差異有顯著性(P<0.05,P<0.01,P<0.01)(表1,圖2)。

(3)HSP70表達細胞和TUNEL陽性細胞在4個區(qū)內(nèi)差別纖維帽和肩部中HSP70高表達細胞百分數(shù)均各大于TUNEL陽性細胞百分數(shù)(P<0.05,P<0.01),脂核區(qū)TUNEL陽性SMCs、ICs細胞百分數(shù)均各大于HSP70陽性細胞百分數(shù)(P<0.01,P<0.01)。在中膜平滑肌區(qū)HSP70陽性SMCs、ICs細胞百分數(shù)分別與TUNEL陽性SMCs、ICs細胞百分數(shù)差異有顯著性(P<0.01,P<0.05)(表1)。

3 討論

HSP(熱激蛋白)可以調節(jié)多種蛋白質的活性和功能,但又不參與靶細胞的組成,所以我們又將其稱為“分子伴侶”或“伴侶蛋白”。HSP具有維護細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性、提高細胞對應激原的耐受性和協(xié)同免疫作用[2]。

H S P按分子量大小分為以下幾個家族:HSP100、HSP90、HSP70、HSP60、小分子HSP(分子量為22～32ku)和泛素(分子量為7～8ku),其中[3～4]HSP60和HSP70能夠激活人體血管內(nèi)皮細胞表達,調節(jié)免疫反應。每個家族又由多個成員組成。隨著研究的不斷深入,新發(fā)現(xiàn)的HSP將不斷加入相應的家族,也可能組成新的家族。

在HSP家族中,主要的是HSP70家族(分子量為72～80ku),成員最多,共有21種蛋白質,是一組在進化上高度保守的應激蛋白。依據(jù)劃分標準的不同,對HSP70家族的分類也不完全相同。大致可分為以下4種:第1種是HSP70,也稱為HSP72,通常在正常細胞中并不表達或表達量很少。但是在熱應激或其它應激原的作用下,則表達迅速增加,屬于誘導型HSP70;第2種為HSC70(熱應激同源蛋白70,heat shock cog-nate 70),也稱為HSP73,是哺乳動物細胞內(nèi)的結構蛋白,在所有的細胞內(nèi)均能表達,并且受熱誘導,屬于結構型HSP70;這2種HSP具有高度的序列同源性(95%)和相似的生物化學特性;第3種是GRP78(葡萄糖調節(jié)蛋白78,glu-cose-regulated protein 78),這種蛋白存在于內(nèi)質網(wǎng)腔內(nèi);第4種是GRP75,主要位于線粒體內(nèi);GRP78和GRP75在應激時稍有表達,它們在細胞內(nèi)分別以分子伴侶的形式發(fā)揮作用。

HSP70家族具有以下生化特點:(1)它們的氨基端具有弱的ATPase活性,與肌肉的肌動蛋白結構很相似;(2)當ATPase被激活時,可與伸展的多肽結合;(3)還可以保護各種酶免受熱損傷,使聚合的蛋白質解聚。通過以上實驗,觀察到兔易損斑塊HSP70在纖維帽區(qū)和肩部區(qū)高度表達, 細胞成分以炎細胞如巨噬細胞為主,平滑肌細胞次之,可能與該區(qū)受到的切應力變化大有關;在基底部表達明顯減少,與HSP的保護作用有關,但炎細胞中表達增高,與HSP的誘發(fā)炎癥有關。

HSP70在抗細胞凋亡、抗氧化和免疫反應中起著重要作用。研究發(fā)現(xiàn),細胞內(nèi)HSP70水平的增高可以阻斷信號通路,抑制應激誘導的JNK激活,從而減少細胞的凋亡。HSP70還能抑制另一種應激激酶p38(HOG1)的活性,但當HSP70家族的單克隆抗體存在時,這種抑制作用就會消除,p38的活性提高,造成細胞損害。另外,研究者還發(fā)現(xiàn)當細胞與氨基酸類似物一起孵育時,細胞內(nèi)異常蛋白積聚,導致JNK、p38等應激激酶的激活,這種激活現(xiàn)象也能被HSP70的過量表達所阻斷。因此,在應激狀態(tài)下,細胞內(nèi)HSP70家族基因表達水平的增加,可抑制應激激酶激活,具有保護作用。

通過TUNEL技術,檢測兔易損斑塊中的凋亡細胞,發(fā)現(xiàn)凋亡的細胞主要集中在脂核區(qū)及其附近,同時HSP呈現(xiàn)低表達,即HSP高表達的地方細胞凋亡少,充分說明了HSP能夠防止細胞凋亡,具有細胞保護作用。

[1]張鵬飛,張運,張梅,等.頸動脈粥樣斑塊應變及應變率分布的初步探討[J].中華超聲影像學雜志,2004,13(8):573～576.

[2]Hayashi K,Imai Y.Tensile property of atheromatous plaque and an analysis of stress in atherosclerotic wall[J].J biomech,1997,30(6):573～579.

[3]Gotto AM.Lipid-lowering therapy for the primary prevention of coronary heart disease[J].J Am Coll Cardiol,1999,33(7):2078～2082.

[4]Ashwini S.Dhume,Krish Soundarajan,William J.Hunter,et al.Comparison of Vascular Smooth Muscle Cell Apoptosis and Fibrous Cap Morphology in Symptomatic and Asyoptomatic Carotid Artery disease[J].Annals of Vascular Surgery,2003,17(1):1～8.