張東方，周美環(huán)，袁長季

（1.中國醫(yī)科大學藥學院生藥教研室，沈陽 110001；2.沈陽東北大藥房連鎖店，沈陽 110023）

在含人工牛黃、牛黃的制劑中，含量測定項常以膽紅素為指標性成分。桂蒲腎清片由人工牛黃、蒲公英、三七、雞內(nèi)金和肉桂等12味中藥組成，在桂蒲腎清片的含量測定中，發(fā)現(xiàn)膽紅素對光穩(wěn)定性較差，為此，考察了光照對膽紅素穩(wěn)定性的影響。同時，并對含量測定方法學進行了考察。

1 儀器、試藥及溶液制備

1）儀器：Waters2695型高效液相色譜議；色譜柱：迪馬Diamonsil（150 mm×4.6 mm）色譜柱。2）試藥：膽紅素為中國藥品生物制品檢定所提供，批號：100077-200503。3）試劑：甲醇、四氫呋喃為色譜純，水為重蒸水，其他試劑為分析純。4）色譜條件：色譜柱：（1）十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（150 mm×4.6 mm）。（2）柱溫25℃。（3）流動相：甲醇-四氫呋喃-0.5%醋酸溶液（80∶10∶10）；流速 1.0 mL/min；檢測波長450 nm。5）對照品溶液的制備 精密稱取膽紅素對照品適量，置棕色量瓶中，加三氯甲烷制成每毫升含29.04 μg的溶液（避光），即得。6）供試品溶液的制備 取本品，研細，取約2 g，精密稱定，精密加入三氯甲烷25 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理15 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用三氯甲烷補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取濾液（避光），即得。

2 實驗方法

2.1 膽紅素穩(wěn)定性考察

2.1.1 穩(wěn)定性實驗 取供試品（批號050501），分別在 0、0.5、1、1.5、2、3、4 h 進樣，結(jié)果見表 1 及圖 1。結(jié)果表明，膽紅素峰面積下降趨勢非常明顯，穩(wěn)定性較差。

表1 穩(wěn)定性實驗結(jié)果Tab.1 Results of stability test for cholerythrin

2.1.2 膽紅素的紫外光譜測試 取膽紅素對照品溶液，分別在對照品溶液配制后（a）、避光放置3 h后（b）及在日光下放置3h后（c），測試紫外光譜，見圖2。從光譜圖可以看出，b與a略有變化，而c與a變化明顯，最大吸收峰有明顯紫移，紫外光譜圖與膽紅素光譜有明顯差別。另外，從溶液外觀可以看出，膽紅素溶液從黃色變?yōu)榫G色。

2.1.3 高效液相色譜（HPLC）法測試 分別取“2.1.2”項下3種溶液，注入液相色譜儀，測定，見圖3。從液相色譜圖可看出，避光放置3 h的色譜峰面積有所下降，而日光下放置3 h后，未檢出膽紅素色譜峰。

圖2 膽紅素紫外光譜圖Fig.2 The UV Spectrum of cholerythrin

2.2 桂蒲腎清片中膽紅素的測定

2.2.1 陰性液干擾實驗 精密吸取對照品溶液、供試品溶液、陰性液各10 μL，注入液相色譜議中，繪制液相色譜圖 3（1、2、3）。由色譜圖可知，在與對照品色譜峰相應的位置上，供試品溶液具有相同保留時間的色譜峰，陰性液在此保留時間處無色譜峰，對本品的含量測定無干擾。

2.2.2 線性范圍考察 精密吸取濃度為27.16 mg/L的膽紅素對照品溶液 1、4、7、10、13 μL，注入液相色譜議，測定。以進樣量為橫坐標，以色譜峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，線性回歸，得回歸方程為：Y=5042118X-11135，r=0.9997，由此可見，膽紅素在0.02716～0.35308 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.3 精密度實驗 取同一供試品溶液（批號050501）按前文方法操作，連續(xù)進樣6次，測定，峰面積的相對平均標準差（RSD）為1.2%。

2.2.4 重復性實驗 取同一批號樣品（050501）6份，分別按前文方法測定，計算，含量的RSD為2.0%。

2.2.5 回收率實驗 精密稱取6份已知含量的同一批號（批號：050501）的樣品1 g，分別精密加入膽紅素對照品溶液（6.79 mg/L）25 mL，按前文方法操作，測定，計算回收率，平均回收率為96.0%，RSD%為0.8%。

3 結(jié)論與討論

1）膽紅素的峰面積積分值在0.5 h測定時，已下降1.6%。供試品溶液制備好后應立即測定。

2）膽紅素是一種四吡咯類化合物，是血紅素的最終分解產(chǎn)物，光照對膽紅素的影響非常大，尤其是400～500 nm波長的藍光或綠光照射后，內(nèi)側(cè)氫鍵斷開，其1個或2個吡咯環(huán)旋轉(zhuǎn)180°，形成3種E構(gòu)型的異構(gòu)體，還可形成不可逆的環(huán)形化合物[1]。因此，膽紅素溶液制備過程中，應特別注意避光。另外，含有膽紅素的中藥材及中藥制劑也應避光保存。

3）膽紅素是親脂性較強的化合物，可溶于三氯甲烷，不易溶于甲醇，幾乎不溶于水。因此，在對照品溶液、供試品溶液制備時，一般可采用三氯甲烷溶劑。另外，采用自動進樣器進樣，常用甲醇、甲醇-水作為洗針溶劑，而甲醇、甲醇-水與三氯甲烷不混溶，由于進樣不完全而使測定不準確，因此，洗針溶劑可改用三氯甲烷。

[1] 姚光弼，膽紅素代謝[J].肝臟，2004，9（3）：44-46.