李繼坤，張艷萍，王 倩，薛小平，楊秀竹

（天津市中西醫(yī)結(jié)合急腹癥研究所，天津 300100）

復(fù)方中藥是中醫(yī)辨證施治的具體體現(xiàn)和實(shí)施方式，被認(rèn)為是中醫(yī)用藥的精髓之一[1]。由于中藥藥效成分復(fù)雜，以及中藥的多層次多靶點(diǎn)作用的特點(diǎn),導(dǎo)致復(fù)方藥物研究存在諸多難點(diǎn)[2-3]。雖然近年來中藥配伍研究取得長足進(jìn)步[3-4]，但是中藥配伍之間的相互作用的篩查仍是一項(xiàng)浩繁的系統(tǒng)工程，目前還沒有理想的實(shí)驗(yàn)方法。噻唑藍(lán)比色分析方法（MCA）是一種簡單準(zhǔn)確、快捷的測定細(xì)胞活性的方法，廣泛應(yīng)用在細(xì)胞學(xué)研究領(lǐng)域[5]。本實(shí)驗(yàn)選用MCA測定方法對大黃與丹參、復(fù)方丹參、白及配伍對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞增殖活性進(jìn)行了初步實(shí)驗(yàn)研究。

1 材料與方法

1.1 主要材料 動(dòng)物：清潔級(jí)Balb/c小鼠，雌雄兼用（軍科院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）。主要試劑：DMEM營養(yǎng)液，胎牛血清（Life Technologies，Inc.）；硫基乙醇酸鹽（中國藥品生物制品檢定所）；噻唑藍(lán)（MTT）、L－谷胺酰胺（GIBCO產(chǎn)品）。主要儀器：二氧化碳孵育箱（series 5400美國NAP－CO）；全自動(dòng)酶標(biāo)儀（2010型，奧地利TECAN公司）；細(xì)胞培養(yǎng)用顯微鏡（CK400）。實(shí)驗(yàn)用藥：大黃水煎劑、白及水煎劑（由天津市中西醫(yī)結(jié)合急腹癥研究所藥物研究室提供，每毫升相當(dāng)于生藥1 g）；丹參粉針劑（哈藥集團(tuán)中藥二廠提供。國藥準(zhǔn)字：Z10970093；批號(hào)：070123；400 g/L）；復(fù)方丹參注射劑（上海第九制藥廠提供，國藥準(zhǔn)字：Z13021388；批號(hào)：070512；每毫升相當(dāng)于生藥 2 g）。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物配制及分組 大黃及白及水煎劑用0.22濾膜過濾除菌，選用營養(yǎng)液配成3種濃度（高濃度為：100 g/L；中濃度為：10 g/L；低濃度為：1 g/L）的應(yīng)用藥液備用。丹參粉針劑（高濃度為：400 g/L；中濃度為：4 g/L；低濃度為：4 g/L）、復(fù)方丹參注射劑（高濃度為：200 g/L；中濃度為：20 g/L；低濃度為：2 g/L）兩種藥物同樣用營養(yǎng)液配制備用，調(diào)pH值至7.2～7.4之間。

實(shí)驗(yàn)分組：A組：大黃水煎劑組；B組：白及水煎劑組；C組：丹參粉針劑組；D組：復(fù)方丹參注射劑組；E 組：大黃水煎劑加白及水煎劑組（1∶1）；F 組：大黃水煎劑加丹參粉針劑組（1∶1）；G組：大黃水煎劑加復(fù)方丹參注射劑組（1∶1）；巨噬細(xì)胞對照組；共8組。每組藥物均為3個(gè)濃度。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的分離純化和培養(yǎng)：用3%硫基乙醇酸鹽（TG）0.5 mL注入小鼠腹腔內(nèi)（每次實(shí)驗(yàn)8只），誘導(dǎo)腹腔巨噬細(xì)胞聚集，48 h后，斷頸處死。用75%乙醇浸泡1～2 min，固定于解剖臺(tái)上。用眼科剪刀在下腹部皮膚做V字切口，向上剝離皮膚，而后向腹腔內(nèi)注入堿性磷酸鹽緩沖液（PBS），5 mL，輕揉腹壁后，抽出腹腔液體放置離心管中。以1500 r/min速度離心10 min，棄上清液，加入DMEM培養(yǎng)液10mL重新懸浮細(xì)胞，再用1500r/min速度離心10 min，棄上清液。沉淀的細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM營養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，加入培養(yǎng)瓶中，置5%二氧化碳（CO2）、37℃培養(yǎng)箱中孵育2 h后，輕搖培養(yǎng)瓶棄除未貼壁的細(xì)胞。重新用10%胎牛血清的DMEM營養(yǎng)液懸浮貼壁細(xì)胞，臺(tái)酚蘭染色計(jì)數(shù)細(xì)胞成活率大于95%則可使用，調(diào)細(xì)胞濃度至 1×109個(gè)/L備用。

1.4 實(shí)驗(yàn)步驟 將濃度為1×109個(gè)/L的巨噬細(xì)胞懸液0.18 mL接種于96孔板各孔中培養(yǎng)，24 h后細(xì)胞處于增殖期，將各種藥物0.02 mL分別加入96孔板各孔中，每組做6個(gè)平行孔。放入5%CO2孵育箱中培養(yǎng)，分別于24、72、120 h測定細(xì)胞活性。培養(yǎng)結(jié)束前 4 h 摻入 MTT（5 g/L）20 μL 繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后棄上清液，加入1∶300鹽酸-異丙醇溶液100 μL,置微量振蕩器振蕩10 min，用2010型全自動(dòng)酶標(biāo)儀于620 nm測定OD值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Untitled-SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較應(yīng)用單因素方差分析做統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，P<0.05表有顯著性異。

2 結(jié)果

丹參粉針劑高濃度、中濃度、低濃度對腹腔巨噬細(xì)胞活性有促進(jìn)作用；而隨著時(shí)間的延長促進(jìn)作用逐漸消失。復(fù)方丹參注射液只有高濃度對腹腔巨噬細(xì)胞活性有促進(jìn)作用。白及中濃度在24 h對腹腔巨噬細(xì)胞活性有抑制作用P<0.01。見圖1。

大黃水煎劑加白及水煎劑組高濃度、中濃度、對腹腔巨噬細(xì)胞活性有抑制作用；而中濃度隨著時(shí)間的延長抑制作用逐漸消失。大黃水煎劑加丹參粉針劑組高濃度、中濃度、低濃度對腹腔巨噬細(xì)胞活性有促進(jìn)作用。大黃水煎劑加復(fù)方丹參注射劑組僅高濃度、中濃度24 h時(shí)對其有促進(jìn)作用。見圖2。

各組間相比，大黃水煎劑加丹參粉針劑組對腹腔巨噬細(xì)胞活性的促進(jìn)作用效果最好；大黃水煎劑加白及水煎劑組對腹腔巨噬細(xì)胞活性具有抑制作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：大黃與不同的藥物結(jié)成藥對可以產(chǎn)生顯著不同的效果。見表1。

表1 大黃與白及、丹參粉針劑、復(fù)方丹參配伍對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞活性的影響(±s)Tab.1 Effect of rhubarb combined with Bletilla striata,salvia miltiorrhiza,compound salvia miltiorrbiza on the activity of peritoneal macrophage cell(±s)

表1 大黃與白及、丹參粉針劑、復(fù)方丹參配伍對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞活性的影響(±s)Tab.1 Effect of rhubarb combined with Bletilla striata,salvia miltiorrhiza,compound salvia miltiorrbiza on the activity of peritoneal macrophage cell(±s)

注：與對照組比較（抑制），誗P<0.01；與對照組比較（抑制），#P<0.05；與對照組比較（促進(jìn)），★P<0.01；與對照組比較（促進(jìn)），*P<0.05。

組別高劑量組中劑量組低劑量組對照組n6666大黃與白及161.50±43.3誗218.83±84.29#335.66±39.89337.16±21.42大黃與丹參589.16±42.14★547.66±61.19★387.83±36.56*350.83±14.93大黃與復(fù)方丹參577.00±17.88★441.16±84.29★356.50±68.49350.83±14.93

3 討論

中藥配伍規(guī)律是中醫(yī)藥理論的精華之一，開展中藥配伍研究對繼承和發(fā)展中醫(yī)藥理論，具有重要的理論意義。方劑的配伍規(guī)律一直是古今醫(yī)家苦苦探尋的焦點(diǎn)，也是近年來方劑研究的重點(diǎn)課題?；钛c清下藥物配伍治療腹部疾病的臨床和基礎(chǔ)研究取得重大進(jìn)展[4]。本實(shí)驗(yàn)選取其中的清下要藥大黃、活血藥物丹參、并選擇止血藥白及進(jìn)行配對研究。探討藥對的協(xié)同增效作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明大黃與不同的藥物結(jié)成藥對可以產(chǎn)生顯著不同的效果。此為中藥配伍用藥提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

大黃具有瀉下攻積、瀉火解毒、活血祛瘀、利膽退黃等功效，因其療效卓著、歷代沿用不衰。特別是許多醫(yī)家精于配伍變化，拓寬了大黃的適應(yīng)范圍，積累了豐富的用藥經(jīng)驗(yàn)[2]。丹參具有祛瘀止痛、活血通經(jīng)、清心除煩等功效，臨床廣泛用于活血化瘀、消炎和心腦血管疾患等癥，是國內(nèi)外現(xiàn)代化中藥研究的熱點(diǎn)品種之一。復(fù)方丹參注射液是由丹參和降香組成,降香功能為行氣止痛，活血止血等功效。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示大黃與丹參、復(fù)方丹參配伍能夠協(xié)同增強(qiáng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞增殖活性，而大黃加丹參組有優(yōu)于大黃加復(fù)方丹參組趨勢。形成這種趨勢的原因可能是中藥降香在其中調(diào)控的結(jié)果。

中藥白及具有收斂止血、清熱利濕、消腫生肌之功效，是一種常用的中藥。大黃與白及配伍顯著抑制小鼠腹腔巨噬細(xì)胞增殖活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，具有止血功效的藥味協(xié)同大黃增強(qiáng)抑制巨噬細(xì)胞增殖活性，同時(shí)驗(yàn)證了具有止血功效的中藥降香下調(diào)巨噬細(xì)胞增殖活性的趨勢。但是中藥白及和降香兩種藥物，是否能協(xié)同大黃進(jìn)一步調(diào)控巨噬細(xì)胞增殖活性，有待于深入研究。

[1] 鄧文龍.試論中藥復(fù)方配伍合理性研究與評(píng)價(jià)[J].中藥藥理與臨床,2008，24（1）：73-76.

[2] 曹蘭秀，頓寶生.試從中藥配伍的特殊性談中藥復(fù)方藥動(dòng)學(xué)研究[J].陜西中醫(yī),2008，29（1）：96-98.

[3] 劉昌孝.中藥藥代動(dòng)力學(xué)研究的難點(diǎn)和熱點(diǎn)藥學(xué)學(xué)報(bào)[J].2005，40（5）：395-401.

[4] 張志芳，郭 靜，劉晉權(quán).近十年來中藥藥對研究進(jìn)展[J].內(nèi)蒙古中醫(yī)藥,2007，26（1）：70-73.

[5] Fang Wang,Li-ting Cao，Song-hua Hu.A rapid and accurate 3-(4,5-dimethyl thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide colorimetric assay for quantification of bacteriocins with nisin as an example[J].Zhejiang Univ Sci B,2007,8(8):549-554.