孫玉華 賀維亞

河南大學(xué)淮河醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 開(kāi)封 475000

近年來(lái)研究證實(shí),雌激素對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后有保護(hù)作用,并能改善記憶和認(rèn)知功能[1],但其作用機(jī)制尚不十分清楚。為此,我們通過(guò)免疫組化、RT-PCR方法,觀察雌二醇對(duì)VD大鼠海馬CA1區(qū)MAP-2蛋白含量和MAP-2mRNA,SYN蛋白含量和SYNmRNA表達(dá)的變化,探討雌二醇在調(diào)節(jié)VD大鼠神經(jīng)突觸可塑性中的作用。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物與分組動(dòng)物均選用＞16月齡的健康Wister大鼠60只,體質(zhì)量450～550 g,由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。以Y型電迷宮法篩選記憶良好的大鼠60只[2],隨機(jī)分成假手術(shù)組、模型組、治療組。治療組于術(shù)后第2天起予以腹腔注射17β-雌二醇(花生油溶解500 μ g/mL),假手術(shù)組和模型組給予等量消毒花生油。連續(xù)給藥30次,隔天1次,共60 d。

1.2試劑17β-雌二醇(美國(guó)Sigma公司);SP免疫組化染色試劑盒、兔抗M AP-2多克隆抗體、兔抗SYN多克隆抗體(均購(gòu)自北京中山生物技術(shù)有限公司)。

1.3動(dòng)物模型的建立根據(jù)Olsson方法[3],術(shù)前12 h禁食、6 h禁水。10%水合氯醛(0.30 mL/100 g)腹腔注射麻醉,沿腹側(cè)頸正中切開(kāi),氣管旁分離出雙側(cè)頸總動(dòng)脈,以“0”號(hào)線雙重結(jié)扎頸總動(dòng)脈。假手術(shù)組動(dòng)物行頸前切開(kāi),分離但不結(jié)扎頸總動(dòng)脈。

1.4觀察指標(biāo)

1.4.1 MAP-2和SYN免疫組織化學(xué)染色過(guò)程:石蠟切片常規(guī)制備過(guò)程。

1.4.2 半定量RT-PCR測(cè)定MAP-2和SYN蛋白mRNA:①PCR引物序列及擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度依照己知的合成:M AP-2,SYNcDNA序列,由上海捷倍思基因技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)。βactin上游5'CCTCTATGCCAACACAGTGC3'下游5'GTACT CCTGCT TGCTGATCC3'擴(kuò)增長(zhǎng)度長(zhǎng)度為211bp,MAP-2上游 5'AGCACACGAAGCAGGGTACA3'下游5'GCAATAGAATCAAGGCAAGAC 3'擴(kuò)增長(zhǎng)度長(zhǎng)度為259bpSYN上游5'C ACGGACCCAGAGA ACATTA 3'下游5'GGACT TCACTGACCAGAT TAC 3'擴(kuò)增長(zhǎng)度長(zhǎng)度為447bp。②組織總RNA的抽提嚴(yán)格按試劑盒操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。③RNA電泳鑒定總RNA完整性,測(cè)定總 RNA純度、濃度,RT-PCR反應(yīng)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示,然后運(yùn)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA),多個(gè)樣本均數(shù)的兩兩比較用q檢驗(yàn)法。取α=0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 MAP-2和SYN免疫組織化學(xué)染色結(jié)果Sham組MAP-2及SYN陽(yáng)性產(chǎn)物呈黃褐色,主要位于神經(jīng)元胞體中,呈纖維條索狀,連續(xù);VD組在術(shù)后 60 d時(shí),海馬CA1區(qū)陽(yáng)性產(chǎn)物脫失加重,連續(xù)性破壞,部分幾乎全部脫失,僅見(jiàn)粗大、深染顆粒。E組海馬CA1區(qū)陽(yáng)性產(chǎn)物脫失明顯減輕。術(shù)后各組海馬神經(jīng)元MAP-2及SYN表達(dá)水平的比較顯示,VD組和E組M AP-2陽(yáng)性產(chǎn)物光透過(guò)值(OD)均高于Sham組(P＜0.05),VD組的MAP-2陽(yáng)性產(chǎn)物光透過(guò)值(OD)均顯著高于E組(P＜0.05),見(jiàn)表1。

表1 海馬CA1區(qū)MAP-2和SYN的OD值比較

表2 海馬 CA1區(qū)MAP-2 M RNA和SYN mRNA相對(duì)表達(dá)率

2.2 MAP-2 mRNA和SYN mRNA半定量RT-PCR結(jié)果與Sham組比較,VD組和E組海馬神經(jīng)元MAP-2mRNA及SYNmRNA相對(duì)表達(dá)量顯著減少P＜0.05):且VD組少于E組(P＜0.05)。見(jiàn)表2。

3 討論

MAP-2是神經(jīng)元的一種骨架蛋白,主要存在于神經(jīng)元的樹(shù)突中。Li等[4]發(fā)現(xiàn),局灶性腦缺血再灌注6 h,在缺血中心區(qū)即有MAP-2的蛋白表達(dá)的增高,本研究發(fā)現(xiàn)VD組和E組MAP-2的mRNA和蛋白的表達(dá)在術(shù)后均降低,提示2-VO術(shù)后均有神經(jīng)元的進(jìn)一步損害。術(shù)后60 d雌二醇組MAP-2mRNA和蛋白的表達(dá)均高于VD組(P＜0.05),提示雌二醇治療可以增加VD大鼠海馬MAP-2的表達(dá)。說(shuō)明雌二醇可能在2-VO術(shù)后促進(jìn)海馬神經(jīng)元發(fā)出新突起。

而突觸素(SYN)是突觸囊泡的一種鈣結(jié)合蛋白,參于神經(jīng)遞質(zhì)的釋放,突觸的形成是突觸功能的生化物質(zhì)基礎(chǔ)。因此,在許多神經(jīng)結(jié)構(gòu)重建研究中,SYN被用作神經(jīng)末梢的定量指標(biāo)[5-6]。本研究發(fā)現(xiàn):術(shù)后60 d雌二醇組SYNmRNA和蛋白的表達(dá)均高于 VDO Perrella和Bhavnani[7]發(fā)現(xiàn) 17β-雌二醇可以減少神經(jīng)細(xì)胞的死亡。在新生嚙齒動(dòng)物海馬區(qū)大腦皮質(zhì)或下丘腦獲得的分散細(xì)胞中加入雌激素,能導(dǎo)致神經(jīng)樹(shù)突生長(zhǎng),突觸增多[8]。本研究提示,雌二醇治療可以增加VD大鼠海馬SYN的表達(dá),減輕突觸受損,促進(jìn)突觸重建,這些研究為雌激素應(yīng)用于臨床治療VD提供理論依據(jù)。

[1]王建平,張芳芳,劉春嶺,等.不同劑量17β-雌二醇對(duì)血管性癡呆大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用[J].中國(guó)腦血管病雜志,2008,5(2):64-69.

[2]An YH,Xie XY,Chen ZR,et al.Influence of acidic pepitide on learning and memory of rats with Alzheimerdisease[J].Zhongguo Linchuang Kangfu,2006,10:185-187.

[3]Olsson Y,Brun A,Engiuund E.Fundamental pathological lesions in vascular dementia[J].Acta Neurol Suppl,1996,168:31-38.

[4]Li Y,Jiang N,Powers C,et al.Neuronal damage and plasticity identified by microtubu-leassociated protien 2,growth-associated protein 43,and cyclin D ilnmunoreactivityafterfocal cerebralischemiainrats[J].Stroke,1998,29:1 972-1 981.

[5]Masliah E,Fagan AM,Terry RD,et al.Reactive synaptogenesis assessed by sy napto-phys in immunoreactivity is associated with GAP-43 in the dentate,gyrus of the adult rat[J].Eex p Neural,1991,113:131-142.

[6]Brock TO,O'Callaghan JP.Quantitative change in the synapsin 1 and p38 and Astroc-yes specific protein glial fibrilary acidic protein are associated with chemical-induced injury to the rat central nervous system[J].J Neurosci,1987,7:931-942.

[7]Perrella J,Bhavnani BR.Protection of cortical cells by equine estrogens against glutamate-induced excitotoxicity is mediated through a calcium independent mechanism[J].BMC Neurosci,2005,6:34.

[8]Kretz O,Fester L,Wehrenberg U,et al.Hippocampal sy napses depend on hippoca-mpal estrogen synthesis[J].Neurosc,2004,24:5 913-5 921.