聞公靈 婁季宇 白宏英

1)河南南陽(yáng)市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 南陽(yáng) 473009 2)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450014

研究發(fā)現(xiàn)腦缺血再灌注損傷時(shí)的炎癥反應(yīng)促進(jìn)了腦梗死的繼發(fā)性腦損害。細(xì)胞間黏附分子1(intercellular adhesion molecule1,ICAM-1)是最重要的白細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞間黏附分子之一,其在腦缺血再灌注損傷中的作用成為急性缺血性腦卒中研究的熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)將通過(guò)觀察bFGF對(duì)缺血再灌注腦組織中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和對(duì)ICAM-1表達(dá)的檢測(cè),探討bFGF對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥選擇體質(zhì)量為270～320 g的健康SD大鼠48只,雌雄各半(由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供),隨機(jī)分成假手術(shù)組、缺血再灌注組、bFGF組,每組16只。bFGF為北京雙鷺?biāo)帢I(yè)股份有限公司研制,用注射用水稀釋,bFGF組腹腔注射10μ g/kg,其余組腹腔注射等量生理鹽水,缺血后即刻給藥。

1.2動(dòng)物模型制作用體積分?jǐn)?shù)為10%的水合氯醛300 mg/kg麻醉,采用 Longa等[1]的線栓法建立大腦中動(dòng)脈(MCA)閉塞模型。缺血再灌注組及bFGF組均給予缺血1 h再灌注24 h,屆時(shí)灌注取腦、固定、脫水、透明、包埋。假手術(shù)組除不插線外,余同上。

1.3大鼠腦含水量的測(cè)定造模后,快速斷頭,開(kāi)顱取腦,取右側(cè)前腦1/4部分稱(chēng)重(濕腦重),然后在 110°C烤箱中烤至恒重,分析天平稱(chēng)重(干腦重),計(jì)算腦含水量%=(濕腦重-干腦重)/濕腦重×100%。

1.4腦缺血后腦毛細(xì)血管通透性測(cè)定每組取8只大鼠,假手術(shù)組于尾靜注伊文思藍(lán)50 mg/kg,不阻斷大腦中動(dòng)脈,其余兩組則在阻斷大腦中動(dòng)脈前5 min由尾靜注伊文思藍(lán)50 mg/kg。缺血1 h再灌注24 h后,斷頭取腦,稱(chēng)重,將腦浸泡于5 mL甲酰胺中,在45°C恒溫箱中溫育72 h。取溫育液,用722型分光光度計(jì)在620 nm處測(cè)定吸收度,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出腦內(nèi)伊文思藍(lán)的含量(ug/g濕腦重)。

1.5腦缺血大鼠腦組織形態(tài)觀察每組取8只大鼠,屆時(shí)灌注取腦、固定、脫水、透明、包埋。HE染色,光鏡檢查。觀察白細(xì)胞浸潤(rùn)。

1.6免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)ICAM-1 采用SABC法,石蠟切片常規(guī)脫蠟至水,過(guò)氧化氫封閉,抗原熱修復(fù) 20 min,血清封閉,滴加1∶100兔抗ICAM-1抗體(購(gòu)自博士德生物公司),4℃過(guò)夜,0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(phosphate bufferad satine,PBS)洗,滴加生物素化的羊抗兔IgG 37℃孵育1 h,PBS洗,滴加ABC復(fù)合物37℃孵育1 h,PBS液洗,DAB顯色,鏡下控制反應(yīng)時(shí)間,雙蒸水終止反應(yīng),脫水、透明、封片、顯微鏡觀察。10×40倍光鏡下,在缺血區(qū)計(jì)數(shù)5個(gè)視野,計(jì)數(shù)陽(yáng)性微血管數(shù)(血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿、胞膜被染成棕黃色顆粒狀),取其均值,以陽(yáng)性微血管數(shù)/高倍視野表示。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行處理,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示,組間比較采用 t檢驗(yàn)。取α=0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn),P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1缺血再灌注腦組織含水量的變化及bFGF對(duì)其的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,大鼠缺血1 h再灌注 24 h后,腦組織出現(xiàn)明顯水腫,表現(xiàn)為腦缺血再灌注組腦含水量與假手術(shù)組比較有明顯增加,有顯著性差異;而bFGF組腦含水量較缺血再灌注組明顯減少,有顯著性差異。表明bFGF能夠?qū)挂蚰X缺血再灌注造成的腦組織水腫現(xiàn)象。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 缺血再灌注腦組織含水量的變化及bFGF對(duì)其影響 (s)

表1 缺血再灌注腦組織含水量的變化及bFGF對(duì)其影響 (s)

與缺血再灌注組比較,△P＜0.05

組 別 n 含水量(%)假手術(shù)組 8 75.38±10.71缺血再灌注組 8 84.92±13.58 bFGF組 8 77.81±9.43△

2.2缺血再灌注腦血管通透性的變化及bFGF對(duì)其的影響結(jié)果表明,與假手術(shù)組比較,腦缺血再灌注組大鼠腦血管通透性增加,表現(xiàn)為單位腦組織伊文思藍(lán)含量顯著升高bFGF組腦組織中伊文思藍(lán)含量明顯減少,使單位腦組織伊文斯藍(lán)含量恢復(fù)至正?；蚪咏Ｋ?與缺血再灌注組比較有顯著性差異。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 缺血再灌注腦血管通透性的變化及bFGF對(duì)其影響 (s)

表2 缺血再灌注腦血管通透性的變化及bFGF對(duì)其影響 (s)

△與缺血再灌注組比較,P＜0.05

組 別 n 伊文斯藍(lán)含量(ug·g-1)假手術(shù)組 8 4.01±0.83缺血再灌注組 8 7.51±1.69 bFGF組 8 5.25±2.63△

2.3缺血再灌注腦組織形態(tài)學(xué)變化及bFGF對(duì)其的影響鏡下所見(jiàn),假手術(shù)組大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常;毛細(xì)血管腔較窄,神經(jīng)細(xì)胞、毛細(xì)血管周?chē)籍a(chǎn)生空隙。缺血再灌注組腦組織出現(xiàn)明顯的梗死灶,光鏡下可見(jiàn)大量神經(jīng)元變性壞死,間質(zhì)水腫明顯,神經(jīng)細(xì)胞及毛細(xì)血管周?chē)障对鰧?。bFGF組多數(shù)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)較完整,形態(tài)相對(duì)正常,間質(zhì)水腫輕,神經(jīng)細(xì)胞周?chē)鸁o(wú)明顯的空隙,毛細(xì)血管周?chē)目障睹黠@減小。

2.4缺血再灌注腦組織ICAM-1陽(yáng)性表達(dá)血管的變化及bFGF對(duì)其的影響假手術(shù)組未觀察到ICAM-1陽(yáng)性微血管,缺血再灌注組可見(jiàn)較多ICAM-1陽(yáng)性微血管,在腦組織切片中ICAM-1免疫陽(yáng)性染色可見(jiàn)于微血管的內(nèi)皮細(xì)胞上,明顯的免疫陽(yáng)性染色出現(xiàn)在缺血再灌注側(cè)半球,并主要局限于缺血區(qū)。bFGF組ICAM-1陽(yáng)性微血管數(shù)較缺血再灌注組明顯減少(P＜0.05),見(jiàn)表 3。

表3 缺血再灌注腦組織ICAM-1陽(yáng)性表達(dá)血管變化及bFGF對(duì)其影響 (s)

表3 缺血再灌注腦組織ICAM-1陽(yáng)性表達(dá)血管變化及bFGF對(duì)其影響 (s)

與缺血再灌注組比較,△P＜0.05

組 別 n ICAM-1假手術(shù)組 8 ——缺血再灌注組 8 24.41±5.33 bFGF組 8 19.53±5.07△

3 討論

腦缺血再灌注時(shí),缺血灶內(nèi)聚集較多細(xì)胞因子及黏附分子,造成白細(xì)胞大量聚集,阻塞微血管,并釋放大量的炎性介質(zhì),腦組織水腫明顯。腦組織含水量能反映腦水腫的程度。檢測(cè)腦組織中伊文氏藍(lán)含量的高低可反映血腦屏障通透性變化的程度[2]。本實(shí)驗(yàn)采用bFGF干預(yù)大鼠缺血1 h再灌注24 h,測(cè)量各組腦組織含水量、毛細(xì)血管通透性變化情況,結(jié)果顯示缺血再灌注組的腦組織含水量、腦血管通透性明顯增加。

腦缺血再灌注后腦水腫加重的原因是多方面的,其中白細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的牢固黏附及其后所產(chǎn)生一系列的病理反應(yīng)[3],是腦缺血再灌注后血腦屏障破壞和腦水腫發(fā)生的重要原因之一。ICAM-1在白細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的牢固黏附過(guò)程中起重要作用。本實(shí)驗(yàn)觀察到,在損傷區(qū)皮質(zhì),假手術(shù)組未見(jiàn)ICAM-1陽(yáng)性微血管,缺血再灌注組可見(jiàn)較多的ICAM-1陽(yáng)性微血管,在病灶區(qū)及半暗帶區(qū)均可見(jiàn)到。應(yīng)用HE染色觀察缺血區(qū)腦組織病理變化情況,結(jié)果顯示假手術(shù)組大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常,毛細(xì)血管腔較窄,神經(jīng)細(xì)胞、毛細(xì)血管周?chē)籍a(chǎn)生空隙。大鼠MCAO 1 h再灌注24 h后,腦組織出現(xiàn)明顯的梗死灶,光鏡下可見(jiàn)大量神經(jīng)元變性壞死,呈現(xiàn)胞體皺縮、變形、核固縮,胞漿濃縮呈深伊紅染色,神經(jīng)細(xì)胞及毛細(xì)血管周?chē)障对鰧?神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞明顯腫脹,間質(zhì)疏松、水腫。

bFGF是一種重要的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子,廣泛分布于成熟和未成熟的中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi),通過(guò)與其相應(yīng)受體結(jié)合發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。當(dāng)腦組織受到各種損傷時(shí),外源性bFGF能通過(guò)受損的血腦屏障發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用[4]。本實(shí)驗(yàn)顯示缺血即刻給予bFGF,腦組織含水量明顯減少,毛細(xì)血管通透性下降。bFGF組多數(shù)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)較完整,形態(tài)相對(duì)正常,間質(zhì)水腫輕,神經(jīng)細(xì)胞周?chē)鸁o(wú)明顯的空隙,毛細(xì)血管周?chē)目障睹黠@減小。免疫組化法檢測(cè)ICAM-1顯示缺血區(qū)雖仍有較多ICAM-1陽(yáng)性微血管,但較缺血再灌注組相比明顯下降,表明bFGF可抑制缺血再灌注后腦組織ICAM-1的表達(dá),降低血管通透性,減輕缺血區(qū)腦組織水腫。其作用機(jī)制目前尚不清楚,有待進(jìn)一步研究。

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[2]史保中.腦出血的評(píng)價(jià)指標(biāo)及其研究進(jìn)展[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)·神經(jīng)病學(xué)神經(jīng)外科學(xué)分冊(cè),2002,29(3):207-209.

[3]姜亞軍,何家聲,丁德云.腦缺血再灌注期間白細(xì)胞黏附機(jī)制的研究進(jìn)展[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)腦血管疾病分冊(cè),1996,4(5):261-263.

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