陳存武,張 莉,何曉梅,程衛(wèi)兵,馬甲林
(皖西學院化學與生命科學系,安徽省植物生物技術實驗實訓中心,安徽 六安 237012)
鹽膚木(Rhus chinensisMill.)又稱五倍子樹、五倍柴等,屬于漆樹科(Anacardiaceae)鹽膚木屬(Rhus)的落葉灌木或喬木[1],在我國廣泛分布,主要用于生產(chǎn)中藥原料五倍子,是我國的主要經(jīng)濟樹種之一。目前,人們對鹽膚木的研究主要在于如何改進其栽培技術,提高五倍子的產(chǎn)量,而對鹽膚木植株所含有的黃酮類物質的研究報道不多見。筆者研究了鹽膚木植株總黃酮類物質的含量及其最佳提取方法,旨在為更好的開發(fā)利用鹽膚木資源提供理論依據(jù)。
供試材料為鹽膚木(Rhus chinensisMill.),采自皖西學院植物園。
儀器:TU-1901紫外可見光分光光度計(北京普析通用儀器設備有限公司),HH—4數(shù)顯恒溫水浴鍋(國華電器有限公司),101AS-2型不銹鋼數(shù)顯電熱鼓風干燥箱(上海浦東躍欣科學儀器廠),F(xiàn)A-1004電子天平(上海精科天平廠),KQ-500B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。
試劑:蘆丁、NaNO2、Al(NO3)3、NaOH、無水乙醇等,均為國產(chǎn)分析純。
1.3.1 材料處理 在鹽膚木果實成熟時采回植株,清洗干凈,按照樹皮、葉片、葉柄、果實、果皮、種子等進行分類,于103℃烘干至恒重,粉碎過40目篩,分裝備用。采用索式抽提法[2],以無水乙醚為脫脂劑,于45℃水浴加熱脫脂一周以上,直至回流液無色、用玻璃棒蘸取回流液滴在濾紙上風干后無印跡為止,以充分除去樣品中脂類物質和脂溶性色素。脫脂后的樣品除去乙醚備用。
1.3.2 提取條件研究[3](1)單因素實驗:選取浸提溫度、浸提時間、液料比、乙醇濃度等作為影響鹽膚木葉片總黃酮提取率的研究因素。在研究其中的某個因素時,其他因素均以水平3作為實驗參數(shù)。每個被研究的因素設6個水平,每個水平做3個平行樣,計算平均值。每個樣浸提3次,合并浸提液,以總黃酮的提取率為指標,分別找出各因素的最適提取條件。實驗因素與水平設計見表1。
表1 實驗因素與水平
(2)正交實驗:在單因素實驗的基礎上,采用四因素三水平的L9(34)正交試驗,找出最佳提取條件。
1.3.3 黃酮含量測定[4-5]利用黃酮類化合物與鋁鹽反應生成的絡合物,在510 nm處有穩(wěn)定吸收峰的特性,以蘆丁為標準品,采用分光光度法即亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法測定溶液吸光度,得到其中的總黃酮含量。
(1)制作標準曲線:精確稱取103℃烘箱中烘至恒重蘆丁標準品10 mg,用70%乙醇定容至100 mL為標準液。再精確吸取蘆丁標準液0.0,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0 mL 分別置于 6 支具塞試管中,各補水至5 mL。加5%NaNO2溶液0.3 mL,搖勻后放置6 min,加10%Al(NO3)3溶液0.3 mL,搖勻后放置6 min,再加4%NaOH溶液4 mL,加水0.4 mL,搖勻后放置15 min,在510 nm處測吸光度。計算吸光度-濃度曲線及回歸方程。
(2)樣品中總黃酮含量的測定:分別取各樣品的浸提液,按照標準曲線相同的方法,測定其510 nm處的吸光度,根據(jù)回歸方程計算其總黃酮含量。
1.3.4 鹽膚木植物各部分的總黃酮提取率測定分別精確稱取1.0 g除脂后的鹽膚木葉片、葉柄、樹皮、果實、果皮、種子等,按照正交實驗得到的最佳提取條件回流浸提10次,合并浸提液,測定其總黃酮含量,計算其總黃酮提取率。各做3個平行樣,計算其平均值。
鹽膚木總黃酮提取率(%)=提取液所含黃酮質量(g)/鹽膚木原料質量(g)×100
按照1.3.3的方法制作的黃酮測定標準曲線如圖1,其回歸方程y=1.256 6x-0.004 1,相關系數(shù)R2=0.999 6,可以用作黃酮含量測定使用。
2.2.1 浸提溫度對鹽膚木葉片總黃酮提取率的影響 按照表1中設定的浸提溫度,其他因素均以水平3作為實驗參數(shù),對鹽膚木葉片總黃酮的提取率進行實驗研究,其結果見圖2。
圖1 蘆丁標準曲線
由圖2可以看出,隨著溫度升高,葉片總黃酮的提取率由 40℃時的 1.8%升高到 70℃時的4.04%,但當溫度超過70℃時提取率有所下降??紤]到溫度對黃酮成分穩(wěn)定性的影響,浸提溫度以70℃比較合適。
圖2 浸提溫度對鹽膚木葉片總黃酮提取率的影響
2.2.2 提取時間對鹽膚木葉片總黃酮提取率的影響 按照表1中設定的提取時間,其他因素均以水平3作為實驗參數(shù),對鹽膚木葉片總黃酮的提取率進行實驗研究,其結果見圖3。
圖3 提取時間對鹽膚木葉片總黃酮提取率的影響
由圖3可知,隨著提取時間的延長,黃酮類物質的提取率也逐漸增大,但在提取時間達到150 min后,提取率增加的幅度逐漸減小。綜合提取效率等因素,合適的提取時間應選150 min為宜。
2.2.3 液料比對鹽膚木葉片總黃酮提取率的影響按照表1中設定的液料比,其他因素均以水平3作為實驗參數(shù),對鹽膚木葉片總黃酮的提取率進行實驗研究,其結果見圖4。由圖4可以看出,提取劑的液料比為80∶1時,鹽膚木葉片總黃酮的提取率最高,液料比增大或減小都不利于鹽膚木葉片總黃酮的提取。
圖4 液料比對鹽膚木葉片總黃酮提取率的影響
2.2.4 乙醇濃度對鹽膚木葉片總黃酮提取率的影響 按照表1中設定的乙醇濃度,其他因素均以水平3作為實驗參數(shù),對鹽膚木葉片總黃酮的提取率進行實驗研究,其結果見圖5。由圖5可知,隨著乙醇濃度的增高,總黃酮的提取率增大,當乙醇濃度超過90%時提取率降低,當乙醇濃度為95%時,提取率為2.92%??梢娫谝掖紳舛葹?0%時提取效果最佳。
圖5 乙醇濃度對鹽膚木葉片總黃酮提取率的影響
在單因素實驗的基礎上,選取了合適的提取時間、浸提溫度、乙醇濃度、液料比,采用四因素三水平的L9(34)正交試驗,以總黃酮的提取率為指標,對鹽膚木葉總黃酮提取工藝進行研究,實驗結果見表2。
表2 L9(34)正交實驗結果
從表2中的極差R值可以看出,ABCD四因素對鹽膚木葉總黃酮提取率的影響依次是:B>A>C>D,即提取時間影響最大,其次是浸提溫度與料液比,乙醇濃度影響最小。從正交實驗的總黃酮提取率可以看出,第九組即A3B3C2D1,為總黃酮的最佳提取工藝,即在80℃條件下,用70%的乙醇為提取劑,以80∶1的液料比提取180 min,其提取率可以達到5.22%,與單因素實驗結果有一定的差異。
采用正交實驗得到的最佳提取工藝,分別提取鹽膚木葉片、葉柄、樹皮、果實、果皮、種子的總黃酮,共提取10次,合并浸提液。每個樣做三個平行。按照標準曲線方法測定其總黃酮含量,計算提取率。結果如表3所示,鹽膚木葉片、葉柄、樹皮、果實、果皮、種子的總黃酮提取率分別為5.84%、2.32%、1.02%、2.01%、1.80%和0.54%。。
表3 鹽膚木植株各部分的總黃酮提取率 (%)
植物黃酮類物質的提取方法有超聲波法、微波法等多種[6-7],本文采用乙醇為提取劑的有機溶劑提取法,具有設備簡單、操作方便快捷的特點,也容易實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。從單因素實驗結果看,最適合的浸提溫度是70℃,浸提時間是150 min,液料比在80∶1,乙醇濃度為70%,但是正交實驗的最佳提取條件是80℃,80∶1的液料比,70%的乙醇濃度,提取180 min。兩者在浸提溫度與浸提時間上雖然有些差異,但是一次正交實驗的總黃酮提取率就達到5.22%,達到葉片的總黃酮提取得率5.84%的89.4%,這也反映出正交實驗在提取工藝優(yōu)化過程中的優(yōu)選性能。用正交實驗優(yōu)選出的提取工藝提取鹽膚木總黃酮,葉片總黃酮的提取率達到5.84%,高于銀杏葉[11]總黃酮2.87%的提取率,果實的總黃酮提取率也達到2.01%。這說明該優(yōu)化工藝合適鹽膚木總黃酮的提取,鹽膚木總黃酮含量較高,具有較高的應用價值,有待于進一步的開發(fā)研究。
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