龔 蓉 ，鐘菲菲 ，2，黃志剛

（1.湖南農業(yè)大學生物科學技術學院，湖南 長沙 410128；2.長沙市食品質量安全監(jiān)督檢測中心，湖南 長沙 410018）

生長素（auxin）是最早被發(fā)現(xiàn)的一類植物激素，參與調控植物生長和發(fā)育的許多方面[1-3]。水稻生長素作用機制的研究對于揭示超級雜交稻超高產機理并指導育種工作具有重要意義。在生長素受體的發(fā)掘過程中，科學家先后發(fā)現(xiàn)了兩種能與生長素發(fā)生特異性結合作用的蛋白質，生長素結合蛋白ABP1[4]與生長素受體蛋白TIR1[5]，但隨后的證據表明ABP1并不是真正的生長素結合蛋白[6-7]。因此，作為發(fā)現(xiàn)的第一個生長素受體，TIR1在生長素作用機制的研究中有著關鍵的意義。隨著研究的不斷深入，TIR1在信號轉導機制上的作用逐漸清晰[8-9]，使得研究者迫切地想了解植物體內TIR1的表達調控機制。真核基因表達調控一直是近代分子生物學的一個研究熱點，轉錄水平的調控，是眾多基因表達調控方式中最直接、最有效的。啟動子是指基因中一段可與RNA聚合酶及其它一些影響轉錄的反式因子結合實現(xiàn)準確有效起始轉錄的DNA序列[10]。作為一種重要的基因表達調控的順式元件，在轉錄水平調控過程中起著關鍵作用，因此啟動子的分離及功能分析不僅是植物基因表達調控研究的重要內容，也是植物基因工程研究的一個重要方面。

本研究擬基于生物信息學方法從超級稻株1 S中克隆OsTIR1的啟動子，并對水稻TIR1啟動子基因功能元件進行分析，將該啟動子與GUS基因融合，于轉基因植物中分析啟動表達的時空特異性及表達強度，為進一步深入研究水稻TIR1的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

超級雜交水稻（Oryza sativa L.）母本株1S由湖南亞華種業(yè)科學研究院提供。轉化受體菌E.coli DH 5α，帶CaMV 35 s啟動子的GUS基因的質粒PBI 121均由本室保存。T4 DNA連接酶、限制性內切酶 Xba I和 Hind III、LA Taq DNA 聚合酶、GC buffer和pMD19-T載體購自TaKaRa公司。質粒提取試劑盒和凝膠回收試劑盒購自安比奧公司。PCR引物合成，測序均由上海英駿生物技術有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 水稻基因組DNA的提取 水稻種子在25℃條件下發(fā)芽，幼苗長到3～4片葉時，采用CTAB法小量提取水稻幼苗葉片基因組DNA。

1.2.2 TIR1啟動子的PCR擴增 根據GenBank上已報道的TIR1基因cDNA的全長序列，設計了克隆TIR1基因啟動子序列的上下游引物，為了便于定向克隆和載體構建，在上游引物和下游引物的5′端分別引入Xba I和Hind III酶切位點：

上游引物5'-GCAAGCTTACAAATCGAGAACCAAGA-3'

下游引物 5'-ATTCTAGACATGCTGCAACGGATCG-3'

劃線部分為引入的酶切位點。以水稻基因組DNA為模板，在上述特異性引物的作用下，進行PCR擴增。PCR擴增反應體系為20μL：DNA模板2μL，上游引物 1 μL，下游引物 1 μL，dd H2O 5.4 μL，2×GC Buffer 10 μL，dNTP 0.4 μL，La Taq DNA聚合酶0.2μL。PCR參數(shù)為：94℃預變性5 min，94℃變性 45 s，54℃退火 40 s，72℃延伸 2.5 min，27個循環(huán)，72℃延伸10 min。

PCR反應完成后，在1%的瓊脂糖凝膠上電泳檢查擴增片段的特異性和大小，然后將含有目的片段的膠塊切下，用瓊脂糖凝膠回收試劑盒進行回收純化。

1.2.3 TIR1啟動子的克隆與重組子的鑒定 將回收后的目的片度與pMD19-T載體連接，轉化大腸桿菌DH 5α感受態(tài)細胞，將轉化產物涂布在含有卡那霉素（Kan）LB培養(yǎng)基平板上篩選轉化子。提取白色單菌落的質粒DNA，用PCR擴增和Hind III/Xba I雙酶切兩種方法鑒定，構建的重組質粒命名為pMD19-pTIR1。將鑒定正確的轉化子送上海英駿生物技術有限公司測序確證。

1.2.4 植物表達載體的構建 將陽性克隆質粒用Xba I和Hind III雙酶切后，同時用相同的限制性內切酶將植物表達載體PBI 121上CaMV 35 S啟動子切除，回收相應的酶切片段，在T4連接酶的作用下將TIR1啟動子酶切片段與PBI 121酶切產物16℃連接過夜，轉化DH 5α感受態(tài)細胞，涂布于含卡那霉素（Kan）抗性的LB平板上，37℃培養(yǎng)過夜，挑單菌落培養(yǎng)，提取質粒進行PCR和雙酶切鑒定，構建的植物表達載體命名為PBI121-pTIR1。

2 結果與分析

2.1 OsTIR1啟動子序列的擴增

以超級雜交稻基因組DNA為模板，用設計的特異性引物進行PCR擴增，擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，得到一條長度約為1 500 bp的特異條帶（圖1），該片段與預期片段大小基本相符。

2.2 OsTIR1啟動子序列的克隆與序列分析

將PCR產物回收純化后，將純化的目的片段克隆入pMD19-T載體后，經PCR擴增和Xba I和Hind III雙酶切后得到的片段與PCR結果相吻合（圖2）。測序結果顯示該片段包含1 530個核苷酸，與NCBI中的TIR1基因的啟動子序列比對后無突變。

圖2 質粒pMD19-pTIR1雙酶切鑒定

圖1 TIR1啟動子PCR擴增

采用植物順式元件分析軟件PLACE和Plant－Care軟件分析所克隆到的OsTIR1基因啟動子序列，發(fā)現(xiàn)其中含有大多數(shù)高等植物啟動子的保守元件，說明它具有潛在的啟動子活性。其中預測發(fā)現(xiàn)了多個具有啟動子的基本轉錄元件13個TATA-box和10個CAAT-box，進一步分析發(fā)現(xiàn)該啟動子序列還包含多個特異性調控元件，包括11個與光應答相關的啟動子序列元件，如AE-box，CATT-motif，G-box，GAG-motif，GT1-motif等。此外，還發(fā)現(xiàn) 1 個厭氧誘導所需的順式調控元件ARE和3個晝夜節(jié)律調控元件Circadian等，序列分析如圖3所示。

圖3 TIR1啟動子序列及其結構

2.3 植物表達載體PBI121-pTIR1的構建

重組質粒pMD19-pTIR1用Xba I和Hind III雙酶切后，回收目的片段，與經同樣酶切的PBI 121植物表達載體連接，從而使TIR1啟動子替換表達載體上的CaMV 35 S啟動子。將連接產物轉化DH 5α，經PCR擴增和雙酶切鑒定均可見約1 500 bp的目的片段（圖4），表明成功地構建了PBI121-pTIR1植物表達載體。

圖4 質粒的雙酶切鑒定

3 討論

生長素是植物生長發(fā)育中起關鍵作用的植物激素，生長素受體作為研究生長素信號傳導鏈的最重要環(huán)節(jié)，研究它的高表達調控機制具有重大的意義。到目前為止，生長素信號轉導途徑并沒有明朗，比如生長素是怎樣促進T1R1-Aux/IAA相互作用的，生長素與Aux/IAA之間的關系問題等。分離TIR1啟動子基因，有助于從基因水平上對生長素信號轉導的研究。

本實驗成功克隆了水稻TIR1基因的啟動子，經 PLACE（http://www.dna.afrc.go.jp/PLACE/signalscan.htm）分析后發(fā)現(xiàn)：在該片段中存在多個順式作用原件如ARE及多種光響應元件如GATA-motif、G-box和CATTmotif等這些都是在光誘導表達啟動子中的保守元件，能夠調節(jié)基因受光誘導后的轉錄活性。Reyes[11]研究表明，在植物中，GATA-box在光誘導和硝酸鹽誘導基因的轉錄過程中起作用；另外還存在多個增強子系和廣東省有一定恢復力的常規(guī)品種，結實率低于50%的組合2個，低于60%的2個，感光的1個，其余均在70%以上，恢復比例97.7%，表現(xiàn)突出的有盛泰A/0510，結實率86.3%，單株重35.8克，比同條件對照金優(yōu)207增產12.3%，比同父異母組合岳4A/0510增產8.7%；在品種比較試驗中，盛泰A/岳恢9113平均產562.8 kg/667m2，比岳優(yōu)9113增產5.86%。

綜合3 a配合力測定情況，盛泰A恢復譜比較廣，在恢復材料范圍內，恢復比例達到96.5%，多數(shù)類型恢復結實達80%以上。其配制的盛泰A/9712、盛泰 A/E318、盛泰 A/9264、盛泰 A/9722、盛泰 A/R018、盛泰A/C402分別進入多個省級區(qū)試的續(xù)試和初試。

2.7 繁殖制種性狀

2007年一季小量繁種，8月3日始穗，花期處于高溫條件下，53.3 m2繁殖收種17 kg，折合產212.5 kg/667m2。2008年小量制種，在岳優(yōu)9113制種基地，盛泰A制100 m2，收種38.5 kg，折合產256.7 kg/667m2，隨機取樣調查，異交結實61.3%，比同條件下的岳4A高8.2個百分點，表現(xiàn)出良好的異交結實特性。

3 小結

經3 a試驗研究，盛泰A農藝性狀穩(wěn)定，花粉敗育徹底，敗育率100%，典敗率99.93%；自交結實率0.027‰；開花習性好，平均花時為10:38，午前花率76.3%，花時較岳4A早13 min，開穎角度30°18′；柱頭外露率83.8%，異交結實性好，良好情況下，一般結實可達60%以上；播始歷期67～86 d，可進行春制和秋制。特別是盛泰A不育系米質優(yōu)，米質遺傳力強，一般配合力好，配組子一代依據父本熟期，可作中遲熟連晚和一季晚稻栽培。盛泰A不育系多個組合在省級區(qū)試中表現(xiàn)突出，在高檔優(yōu)質雜交稻研究上有廣闊的應用前景，建議加速該不育系的開發(fā)應用。

[1]蔣遜平，謝曉陽，歐光輝.新質源優(yōu)質不育系岳4A的選育與應用[J].雜交水稻，1999，14（2）：3-5.

[2]蔣建為，蔣遜平，謝曉陽，等.優(yōu)質雜交水稻新組合岳優(yōu)9113的選育[J].湖南農業(yè)科學，2005，（2）：9-11.

[3]蔣遜平，謝曉陽，張 勝，等.秈型優(yōu)質新不育系絲苗A特征特性研究[J].湖南農業(yè)科學，1999，（2）：14-16.

[4]蔣建為，歐陽光輝，夏照明，等.新組合新香優(yōu)9113的選育與栽培技術研究[J].湖南農業(yè)科學，2008，（5）：18-19.

[5]程式華，李 健.現(xiàn)代中國水稻[M].北京：金盾出版社，2007.