趙永忠，漆志平，周英瓊，霍 群，韋錚武，侯巧燕

（桂林醫(yī)學(xué)院：1.附屬醫(yī)院消化內(nèi)科；2.碩士研究生；3.附屬醫(yī)院病理科，541001；4.生化教研室 541004）

腹水是肝硬化患者最突出的臨床表現(xiàn)，同時(shí)也是提示肝硬化患者預(yù)后不良的因素之一。門(mén)靜脈高壓、低清蛋白血癥及腎功能不全常是引起肝硬化患者腹水形成的主要原因。新近研究表明，門(mén)靜脈高壓在肝硬化腹水形成中起主導(dǎo)作用［1］。然而門(mén)靜脈高壓導(dǎo)致腹水形成的原因尚未徹底闡明。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是目前發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的增強(qiáng)血管通透性的物質(zhì)之一，又是血管發(fā)育、成熟的病理生理過(guò)程中最重要的血管生成因子。作者以前的研究表明，VEGF在門(mén)靜脈高壓大鼠模型中胃組織的表達(dá)是增高的［2］。本研究中作者利用滲透性改變復(fù)制門(mén)靜脈高壓大鼠腹水模型，同時(shí)進(jìn)一步探討門(mén)靜脈高壓狀態(tài)下VEGF與腹水形成的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 56只成年雄性SD大鼠，由日本福岡大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體質(zhì)量220～240g。隨機(jī)分為3組：門(mén)靜脈結(jié)扎（portal vein ligation，PVL）組32只，假手術(shù)（sham－operated，SO）組16只，門(mén)靜脈結(jié)扎聯(lián)合沙利度安（thalidomide）治療（PVL－T）組8只。

1.2門(mén)靜脈高壓腹水模型制備 參照參考文獻(xiàn)［3］制作門(mén)靜脈高壓模型：實(shí)驗(yàn)前24h禁食，自由飲水，予5%戊巴比妥鈉溶液0.11～0.13mL/100g體質(zhì)量腹腔內(nèi)注射麻醉；開(kāi)腹后暴露并游離門(mén)靜脈主干，沿其縱軸外置一根20G鈍性針頭，于近肝門(mén)處用3－0絲線結(jié)扎門(mén)靜脈主干及外置針頭后拔針，形成肝前性門(mén)靜脈狹窄；假手術(shù)組僅游離門(mén)靜脈主干而不結(jié)扎，其余步驟同PVL組。于術(shù)后第1、3、5、7天分別處死PVL組8只和SO組4只。為復(fù)制大鼠腹水模型，作者給每只大鼠腹腔注射33.33%葡萄糖溶液1mL，30min后收集腹水和腸系膜組織標(biāo)本進(jìn)行VEGF測(cè)定。

1.3檢測(cè)項(xiàng)目與方法

1.3.1收集腹水總量與腹水中VEGF含量測(cè)定 麻醉大鼠后開(kāi)腹，收集所得腹水減去注入的葡萄糖1mL即為腹水總量。采用ELISA法測(cè)定腹水中VEGF含量，嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作（VEGF試劑盒購(gòu)自美國(guó)R＆D公司）。

1.3.2門(mén)靜脈壓力測(cè)定 采用與造模相同的方法打開(kāi)腹腔，穩(wěn)定10min后用20G套管針穿刺腸系膜上靜脈近端，退出針芯并將套管送至門(mén)靜脈結(jié)扎遠(yuǎn)端，將該處所測(cè)得的壓力代表門(mén)靜脈壓力；SO組因無(wú)粘連可直接穿刺門(mén)靜脈測(cè)壓，套管針另一端接壓力傳感器（型號(hào)為T(mén)SD104A），傳感器將采集到的壓力信號(hào)轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號(hào)后輸入計(jì)算機(jī)，采用MP－2100型多道生理記錄儀測(cè)定門(mén)靜脈壓力（美國(guó)BIOPAC公司制造），單位以mm Hg表示。

1.3.3組織學(xué)檢查 處死大鼠后剪取少許腸系膜組織，經(jīng)10%中性福爾馬林溶液固定后，常規(guī)石蠟包埋、切片（約4 μm），HE染色，光鏡下觀察腸系膜組織學(xué)改變。

1.3.4腸系膜組織VEGF免疫組化染色 處死大鼠后剪取少許腸系膜組織，經(jīng)10%中性福爾馬林溶液固定24h后，脫水作石蠟包埋、切片（約4μm），采用免疫組化SABC法（兔抗人多克隆VEGF抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司）檢測(cè)腸系膜組織中VEGF表達(dá)情況（嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作），PBS代替一抗做陰性對(duì)照。

1.3.5實(shí)時(shí)RT－PCR檢測(cè)腸系膜組織VEGF mRNA表達(dá)

1.3.5.1提取總RNA 采用Trizol裂解抽提法提取術(shù)后3d各組大鼠腸系膜組織總RNA（試劑盒購(gòu)自美國(guó)Ambion公司），嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.3.5.2逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA 采用ASTEC溫控系統(tǒng)（Pc818，日本）進(jìn)行cDNA合成（cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)A＆B公司），總體積20μL，25℃、10min，37℃、120min，85℃、5s。

1.3.5.3PCR擴(kuò)增 應(yīng)用7500Fast實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)A＆B公司）進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：置PCR儀95℃、20 s，以后95℃、3s，62℃、30s，共40循環(huán)，34min擴(kuò)增產(chǎn)物片段為645bp。采用磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）作為內(nèi)參照。VEGF的上、下游引物和探針?lè)謩e為：5′－AGTGGTCCCAGGCTGCAC－3′，5′－TCCATGAACTTCACCACTTCGT－3′，5′－（FAM）ATGGCAGAAGGAGGAGGGCAGAATCA （TAMRA）－3′。GAPDH 的上、下游引物和探針?lè)謩e為：5′－TGGGTGTGAACCACGAGAA－3′，5′－GGCATGGACTGTGGTCATGA－3′和5′－CTGCACCACCAACTGCTTAGC－3′，其中探針于5′端標(biāo)記熒光發(fā)光基團(tuán)FAM，3′端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)TAMRA。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線精確計(jì)算樣品循環(huán)閾值（Ct值）的比值（任意單位）。

1.3.6沙利度安治療門(mén)靜脈高壓腹水療效觀測(cè) 為阻斷VEGF活性，PVL－T組大鼠術(shù)后連續(xù)3d給予沙利度安（美國(guó)Sigma公司）腹腔注射（100mg/kg），術(shù)后第4天給每只大鼠腹腔注射33.33%葡萄糖溶液1mL，30min后收集腹水和腸系膜組織待檢。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，各組數(shù)據(jù)以s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1PVL組與SO組大鼠門(mén)靜脈壓力變化 見(jiàn)表1。

表1 PVL組與SO組大鼠術(shù)后門(mén)靜脈壓力變化比較（mm Hg，s）

表1 PVL組與SO組大鼠術(shù)后門(mén)靜脈壓力變化比較（mm Hg，s）

與SO組比較，＊：P＜0.05。

組別 第1天 第3天 第5天 第7天PVL組 15.83±0.86＊16.91±0.96＊16.73±1.29＊16.39±1.62＊5.83±0.51 5.92±0.76 6.17±0.89 5.90±0.68 SO組

2.2腹水總量及腹水中VEGF含量 術(shù)后第1、3天PVL組與SO組大鼠腹水總量及腹水中VEGF含量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而術(shù)后第5、7天PVL組與SO組大鼠腹水總量及腹水中VEGF含量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表2、3。

表2 PVL組與SO組大鼠術(shù)后腹水總量比較（mL，s）

表2 PVL組與SO組大鼠術(shù)后腹水總量比較（mL，s）

與SO組比較，＊：P＜0.05，＃：P＞0.05。

組別 第1天 第3天 第5天 第7天PVL組 4.83±1.53＊ 4.92±1.53＊ 4.17±0.29＃ 3.83±0.28＃SO組3.27±0.46 3.40±0.42 3.33±0.28 3.67±0.29

表3 PVL組與SO組大鼠術(shù)后腹水VEGF含量比較（pg/mL，s）

表3 PVL組與SO組大鼠術(shù)后腹水VEGF含量比較（pg/mL，s）

與SO組比較，＊：P＜0.05，＃：P＞0.05。

組別 第1天 第3天 第5天 第7天PVL組 104.0±41.2＊ 226.1±132.2＊ 64.6±2.1＃ 62.2±22.9＃SO組42.6±4.1 62.4±16.7 60.2±17.9 45.6±10.2

2.3腸系膜組織學(xué)改變及VEGF免疫組化染色 PVL組大鼠腸系膜可見(jiàn)毛細(xì)血管和小靜脈明顯擴(kuò)張、扭曲和變形；而SO組缺如，見(jiàn)插頁(yè)Ⅱ圖1。PVL組大鼠腸系膜VEGF染色呈強(qiáng)陽(yáng)性，而SO組則呈弱陽(yáng)性，兩組均在血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿中表達(dá)，見(jiàn)插頁(yè)Ⅱ圖2。

圖1 PVL組與SO組腸系膜組織學(xué)改變（HE染色，×100）

圖2 PVL組與SO組VEGF免疫組化染色（×400）

2.4腸系膜組織VEGF mRNA表達(dá) 術(shù)后第3天PVL組大鼠腸系膜組織VEGF mRNA表達(dá)明顯高于SO組（分別為1.32±0.58、0.43±0.35，P＜0.05）；而 PVL－T組大鼠腸系膜組織VEGF mRNA表達(dá)明顯低于PVL組（分別為0.28±0.08、1.32±0.58，P＜0.05）。

2.5沙利度安腹腔注射后腹水改變 連續(xù)注射3d沙利度安后，PVL－T組大鼠腹水總量明顯小于PVL組［分別為（3.4±0.27）mL、（4.92±1.53）mL，P＜0.05］。

3 討 論

迄今為止，針對(duì)肝硬化患者頑固性腹水的治療仍缺乏有效措施。再者缺乏復(fù)制肝硬化腹水的有效動(dòng)物模型，故作者試圖通過(guò)部分門(mén)靜脈結(jié)扎復(fù)制出大鼠門(mén)靜脈高壓模型后，再采用腹腔注射高滲葡萄糖誘導(dǎo)大鼠腹水形成。

本研究發(fā)現(xiàn)，門(mén)靜脈結(jié)扎后第1、3天腹水形成總量和腹水中VEGF含量均較SO組明顯增高（P＜0.05）；然而，門(mén)靜脈結(jié)扎后第5、7天腹水形成總量和腹水中VEGF含量與SO組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。并且門(mén)靜脈結(jié)扎后第3天腹水形成總量和腹水中VEGF含量達(dá)最高值，換言之，腹水VEGF含量與腹水形成總量呈正相關(guān)，提示VEGF增高后可能通過(guò)增加血管通透性促進(jìn)腹水形成。

免疫組化結(jié)果表明，PVL組大鼠腸系膜VEGF染色呈強(qiáng)陽(yáng)性，而SO組則呈弱陽(yáng)性，兩組主要在血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿中表達(dá)。由于在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，作者觀察到術(shù)后第3天大鼠腹水形成總量和腹水VEGF含量最高，故只選擇術(shù)后第3天大鼠腸系膜作VEGF mRNA分析。結(jié)果表明，術(shù)后第3天PVL組大鼠腸系膜組織VEGF mRNA表達(dá)明顯高于SO組，與Geerts等［4］研究結(jié)果一致。國(guó)外學(xué)者通過(guò)復(fù)制門(mén)靜脈高壓小鼠模型也得出了同樣結(jié)果［5－6］。業(yè)已證實(shí)，VEGF是強(qiáng)有力的血管生成因子，可以引起血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂增生并形成新生血管，減少細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增生，對(duì)不同器官損傷均起到一定保護(hù)作用［7－8］。但研究發(fā)現(xiàn)VEGF促血管再生的同時(shí)亦可使血管通透性增高，導(dǎo)致液體滲出增加。

有資料表明，沙利度安通過(guò)降低TNF2α而下調(diào)VEGF表達(dá)，通過(guò)產(chǎn)生氫氧基等發(fā)揮抗血管新生作用［9－11］。本研究結(jié)果顯示，采用沙利度安腹腔注射3d后大鼠腹水形成總量與PVL組相比明顯減少；同時(shí)腸系膜組織VEGF mRNA表達(dá)亦明顯降低。作者推測(cè)沙利度安可能通過(guò)下調(diào)VEGF表達(dá)來(lái)減少腹水形成。Lopez－Talavera等［12］研究顯示沙利度安可改善門(mén)靜脈高壓大鼠高動(dòng)力內(nèi)臟循環(huán)狀態(tài)，并可降低門(mén)靜脈壓力。

綜上所述，門(mén)靜脈高壓可增加由于滲透性改變所致大鼠腹水形成，VEGF高表達(dá)可能與大鼠腹水形成有關(guān)，抑制VEGF的活性可能是治療肝硬化患者頑固性腹水的一種新的治療策略。

（衷心感謝日本福岡大學(xué)醫(yī)學(xué)部消化內(nèi)科向坂彰太郎教授對(duì)本文的大力支持和幫助）

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