李 敏，張 程，張湘燕

（貴州省人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，貴陽(yáng)550002）

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是機(jī)體在遭受嚴(yán)重感染、創(chuàng)傷、休克等打擊后出現(xiàn)的一種以肺泡毛細(xì)血管損傷導(dǎo)致肺水腫和微肺不張為病理特征的肺部炎癥與通透性增加綜合征，是臨床常見危重癥［1－2］。目前臨床上還缺乏治療ALI的有效手段。有研究表明，補(bǔ)體與ALI密切相關(guān)，補(bǔ)體激活產(chǎn)物C5a在ALI病程發(fā)展中具有啟動(dòng)、放大的重要作用［3－5］。抑制補(bǔ)體能有效減輕肺損傷［6］。但近年來(lái)有研究表明，在脂多糖（LPS）導(dǎo)致的ALI中補(bǔ)體與病程發(fā)展無(wú)關(guān)［7］。由于LPS是ALI發(fā)病的常見誘因，而國(guó)內(nèi)在這一方面幾乎沒有研究報(bào)道。因此探討補(bǔ)體與LPS型ALI的關(guān)系，對(duì)于相關(guān)科學(xué)問題的闡明、臨床治療策略的確定以及藥物研發(fā)都具有重要意義。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器 LPS、抗綿羊紅細(xì)胞抗體購(gòu)自Sigma公司，高純度眼鏡蛇毒因子（cobra venom factor，CVF）由貴州省中國(guó)科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室孫黔云研究員贈(zèng)送（其制備和活性測(cè)定方法分別參見參考文獻(xiàn)［8－9］），TNF－α、IL－8、ICAM－1檢測(cè)試劑盒為美國(guó)ADL公司產(chǎn)品，BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所，綿羊紅細(xì)胞購(gòu)自貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，Bio－Rad 550型酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó) Bio－Rad公司，5810R冷凍離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)eppendorf公司，Revco超低溫冰箱購(gòu)自美國(guó)Thermo公司。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量180～230g，鼠齡10周，由第三軍醫(yī)大學(xué)附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)為SCXK（渝）2007－0005。將大鼠隨機(jī)分為生理鹽水對(duì)照組（對(duì)照組，n＝8）、脂多糖（lipopolysacharide，LPS）損傷組（LPS組，n＝8）、CVF干預(yù)組（CVF組，分為3個(gè)時(shí)間組，每組n＝8）。大鼠經(jīng)10%水合氯醛腹腔注射麻醉。對(duì)照組：尾靜脈注射生理鹽水，2h后采集標(biāo)本。LPS組：尾靜脈注射LPS 5mg/kg，于2h后采集標(biāo)本。CVF組：尾靜脈注射50 u/kg CVF去除補(bǔ)體，24h后尾靜脈注射5mg/kg LPS，然后分別于0.5、2、4h采集標(biāo)本。

表1 各組肺濕/干質(zhì)量比和PALF中PMN比、LPI變化

表2 BALF TNF－α、IL－8、ICAM－1濃度變化（pg/mL）

1.3標(biāo)本收集與指標(biāo)測(cè)定 大鼠麻醉后打開腹腔，從下腔靜脈抽取5mL血，室溫下靜置1h，4℃放置2h，然后4℃、2 000 r/min（離心半徑18cm）離心10min，吸取血清，分裝后置于－80℃保存，用于測(cè)定補(bǔ)體活性和蛋白含量。打開胸腔，切開氣管，經(jīng)氣管插入12號(hào)針頭行右肺肺泡灌洗，每次2mL，共3次，總回收量約為3.6mL。計(jì)數(shù)肺泡灌洗液（broncho alveolar lavage fluid，BALF）中PMN百分比。BALF離心后，取上清液分裝，保存于－80℃，用于蛋白含量、TNF－α、IL－8、ICAM－1測(cè)定。計(jì)算肺通透指數(shù)（lung alveolar permeability index，LPI），即BALF蛋白/血漿蛋白。取左上肺，稱取濕重后，置于80℃烤箱中烤至恒重，稱干重，計(jì)算濕/干重比。取左下肺，經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋切片，HE染色，進(jìn)行病理學(xué)檢查。

1.4血清補(bǔ)體溶血活性測(cè)定 取－80℃凍存大鼠血清于室溫水浴快速化凍，以GGVB緩沖液1∶20稀釋，取100μL稀釋血清與100μL致敏綿羊紅細(xì)胞（5×108/mL）混勻，于37℃水浴孵育，不時(shí)輕輕振搖，30min后加入1mL冷生理鹽水中止反應(yīng)，2 000r/min（離心半徑18cm）離心10min，取上清液，405nm測(cè)定OD值，計(jì)算血清補(bǔ)體溶血活性。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 計(jì)量資料以s表示。采用方差分析或秩和檢驗(yàn)（Kruskal－Wallis法，方差不齊時(shí)用秩和檢驗(yàn)）；多個(gè)樣本間兩兩比較采用q檢驗(yàn)（Newman－Keuls法）或秩和檢驗(yàn)（Nemenyi法）。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1肺組織病理學(xué)檢查 對(duì)照組：肺組織形態(tài)基本正常，肺間質(zhì)有輕度炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（插頁(yè)Ⅰ圖1A）；LPS組：肺間質(zhì)水腫，可見大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，彌漫性出血，血管內(nèi)有血栓形成（插頁(yè)Ⅰ圖1B、C）。CVF組：肺組織各種滲出明顯減少，炎性細(xì)胞滲出減少，但隨著時(shí)間進(jìn)程，炎癥有加重趨勢(shì)（插頁(yè)Ⅰ圖1D、E、F）。

圖1 大鼠肺組織病理學(xué)檢查結(jié)果（HE染色）。

2.2肺濕/干質(zhì)量比和PALF中PMN比、LPI變化 LPS組肺濕/干質(zhì)量比、PALF中PMN比、LPI均明顯高于對(duì)照組；0.5hCVF組肺濕/干質(zhì)量比、PALF中PMN比、LPI明顯低于LPS組；2hCVF組PALF中PMN比、LPI明顯低于LPS組；4hCVF組肺濕/干質(zhì)量比、PALF中PMN比、LPI明顯高于0.5hCVF組（表1）。

2.3BALF TNF－α、IL－8、ICAM－1濃度變化 LPS組 BALF TNF－α、IL－8、ICAM－1濃度明顯高于對(duì)照組，各 CVF組普遍低于LPS組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2）。

2.4血清補(bǔ)體溶血活性變化 對(duì)照組補(bǔ)體溶血度為（0.53±0.12 ）%（n＝5），而 LPS組血清補(bǔ)體溶血度只有（0.30±0.21）%（n＝8），LPS組補(bǔ)體明顯下降。各CVF組大鼠體內(nèi)補(bǔ)體被耗竭，基本上檢測(cè)不出補(bǔ)體溶血活性（數(shù)據(jù)未列出）。

3 討 論

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，在ALI發(fā)病早期，補(bǔ)體系統(tǒng)首先被激活，總補(bǔ)體活性明顯降低，中性粒細(xì)胞聚集活性升高，引起多形核白細(xì)胞（PMN）在肺血管內(nèi)聚集［10］。PMN聚集是ALI的重要發(fā)病因素。因此抑制補(bǔ)體激活能改善或減輕急性肺損傷的癥狀。

本實(shí)驗(yàn)采用CVF去除大鼠體內(nèi)補(bǔ)體。CVF可激活和消耗補(bǔ)體替代途徑成分［9］，常被用于補(bǔ)體相關(guān)疾病研究動(dòng)物模型中去除補(bǔ)體。在本實(shí)驗(yàn)中所采用的CVF劑量可使大鼠在實(shí)驗(yàn)期間處于完全的補(bǔ)體消除狀態(tài)［8］。

本研究表明，在注射LPS后大鼠血清補(bǔ)體活性顯著下降，大鼠出現(xiàn)較典型的ALI癥狀，提示在LPS所致急性肺損傷的發(fā)病過程中有補(bǔ)體的激活和消耗。而預(yù)先用CVF去除補(bǔ)體后大鼠BALF中蛋白和細(xì)胞滲出減少，肺水腫程度和病理改變減輕，說明抑制補(bǔ)體確實(shí)可減輕LPS所致ALI的癥狀。但BALF TNF－α、IL－8、ICAM－1濃度沒有明顯降低。在本實(shí)驗(yàn)中可以看到，抑制補(bǔ)體在ALI早期可以明顯減輕炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，但隨著時(shí)間進(jìn)程，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度加重，提示在LPS導(dǎo)致的ALI中，早期的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)與補(bǔ)體有密切關(guān)系，而其后的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度加重則可能與核因子－κB的激活調(diào)控有關(guān)［11］。Rittirsch等［7］2008年曾報(bào)道在LPS導(dǎo)致的ALI中，補(bǔ)體與病程發(fā)展無(wú)關(guān)。而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果則明確表明，補(bǔ)體參與了LPS所致ALI的早期病程發(fā)展。該文獻(xiàn)采用氣管內(nèi)給予LPS造模，而作者采用尾靜脈注射LPS造模。實(shí)驗(yàn)結(jié)論的不同很可能是這兩種不同的造模途徑在體內(nèi)引起的LPS清除反應(yīng)有差異所致。而靜脈注射LPS造模無(wú)疑與臨床情況更為接近。LPS造模在本實(shí)驗(yàn)中還觀察到對(duì)照組在注射生理鹽水后肺組織有輕度的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，近年來(lái)也有文獻(xiàn)報(bào)道了這一現(xiàn)象［12］。

本研究表明，在內(nèi)毒素（LPS）引起的ALI發(fā)病早期采用抗補(bǔ)體治療策略能有效減輕早期病理癥狀，對(duì)ALI的治療具有積極的意義和價(jià)值，但對(duì)ALI總體病程的影響尚需系統(tǒng)深入的研究與評(píng)價(jià)。

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