張愛平,楊錦艷,王 麗,楊 紅,鄭茂東

川芎嗪(TMP)是從植物川芎根莖中提取分離得到的生物堿單體,具有活血化瘀,抑制血小板聚集、鈣通道阻滯和血栓素的合成,降低血漿內皮素水平等作用,對缺血性腦血管疾病具有良好的療效[1]。

人血清白蛋白(HSA)是血液中的主要蛋白[2]。研究中藥分子與蛋白質[3]的結合機制有利于深入了解中藥的藥效。國內外有關天然藥物分子特別是中藥有效成分與蛋白的相互作用研究領域尚處于起步階段且目前的研究工作主要集中在藥物-蛋白質二元體系,而有關金屬離子對藥物-蛋白質二元體系的影響的研究較少,研究內容系統(tǒng)性不夠,更深層次的規(guī)律尚未得到揭示。因此,開展中藥分子-蛋白質多元體系的研究具有重要意義。

采用紫外光譜法、熒光光譜法和同步熒光光譜法相結合的分析方法,在模擬人體生理條件下,研究TMP與HSA的相互作用,并探討共存金屬離子對TMP與HSA相互作用的影響,為揭示TMP作用機制提供實驗數(shù)據(jù)和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑 Cary Eclipse熒光光度計(Peltier電子恒溫裝置,美國瓦里安公司);TU-1901紫外分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司);Biohit加樣器(芬蘭百得公司);pHS-3C數(shù)字酸度計(上海雷磁儀器廠);HSA(美國Sigma公司);磷酸川芎嗪(中國藥品生物制品檢定所);MgCl2、CoCl2、CuCl2、ZnCl2均為分析純,實驗用水為二次蒸餾水。

1.2 實驗方法 配制0.02 mol/L的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖溶液(pH7.40,內含0.15 mol/L NaCl),然后分別用該緩沖溶液配制1.79×10-4mol/L HSA溶液和5.80×10-4mol/L的TM P溶液。

1.2.1 紫外光譜的測定 固定HSA溶液的濃度,逐漸增加TMP溶液的濃度,在TU-1901紫外分光光度計上記錄200 nm～500nm波長范圍內紫外光譜。

1.2.2 熒光光譜的測定 移取2.0 mL 1.79×10-6mol/L HSA溶液于1 cm石英池中,用可調式移液器逐次加入TMP溶液進行熒光滴定,混合均勻后,以280 nm為激發(fā)波長,在Cary Eclipse熒光光度計上記錄290 nm～500 nm波長范圍內的發(fā)射光譜。

1.2.3 同步熒光光譜的測定 固定HSA溶液的濃度,逐漸增加TMP溶液的濃度,分別在△λ=15 nm和△λ=60 nm下掃描熒光激發(fā)光譜,分別得到HSA中酪氨酸殘基和色氨酸殘基的同步熒光光譜。

2 結 果

2.1 TMP與HSA結合的紫外光譜

2.1.1 TMP與HSA的結合常數(shù)K 加入TMP后,HSA發(fā)生減色效應,表明反應前后HSA所處的微環(huán)境發(fā)生改變,TMP與HSA發(fā)生相互作用形成復合物,從而引起HSA紫外吸收光譜的變化。詳見圖1。

圖1 不同濃度TMP與HSA相互作用的紫外差譜圖

利用Scatchard[4]模型和公式:

(A0-A)-1=A0-1+K-1A0-1[Q]-1

式中:A0——TMP與 HSA作用前的紫外強度;

A——TM P與 HSA作用后的紫外強度;

[Q]——TMP濃度。

以(A0-A)-1對[Q]-1作 Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖,由該圖的斜率和截距,求得TMP與HSA的結合常數(shù)K=1.57×104L/mol,相關系數(shù)r=0.9983。詳見圖2。

圖2 TMP與HSA相互作用的 Lineweaver-Burk圖

2.1.2 金屬離子與TMP結合比的確定(見圖3) 以279 nm處的吸光度A對TMP與金屬離子的摩爾比r作圖,結果見圖4。由滴定曲線可以看出,A隨r的增加而增加,在r接近1.0時出現(xiàn)明顯轉折,表明金屬離子 Mg2+、Co2+、Zn2+、Cu2+均與TMP形成1∶1的配合物。

圖3 金屬離子對TMP滴定曲線

2.2 TM P與HSA作用的熒光分析

2.2.1 TM P對HSA熒光猝滅機制的確定 本文所用的熒光強度均為校正后(扣除川芎嗪的熒光強度和考慮稀釋效應)的值。HSA在340 nm處出現(xiàn)最大熒光峰,其熒光強度被逐漸敏化,扣除 TMP的熒光后,發(fā)現(xiàn)HSA的熒光被TMP有規(guī)律地猝滅。隨著TMP濃度的增加,HSA的熒光發(fā)射峰的強度逐漸減弱,同時伴隨著峰位的明顯藍移,最大藍移幅度超過10 nm。由此表明TM P與HSA發(fā)生結合作用,HSA的構象可能發(fā)生變化。這與紫外測定結果相吻合。詳見圖4。

圖4 308 K時TMP對HSA熒光猝滅圖

熒光猝滅機制[5]通常分為動態(tài)猝滅、靜態(tài)猝滅和非輻射能量轉移。假設TMP對HSA熒光的猝滅是由分子碰撞引起的動態(tài)猝滅,則按照 Stern-Volmer方程[6]:

F0/F=1+Kqτ0[Q]=1+KSV[Q]

式中:F0——蛋白質和猝滅劑作用前的熒光強度;

F——蛋白質和猝滅劑作用前后的熒光強度;

[Q]——猝滅劑的濃度;

Ksv——動態(tài)猝滅常數(shù);

Kq——雙分子猝滅速率常數(shù);

τ0——猝滅劑不存在時物質的熒光平均壽命。

相同實驗條件下測定在298K和308K下TMP對HSA的熒光猝滅情況,由于生物大分子熒光平均壽命大約為10-8s[7],各類猝滅劑對生物大分子最大擴散控制的碰撞猝滅常數(shù)為2.0×1 010L/(mol?s),TMP對HSA的熒光猝滅速率常數(shù)Kq遠大于此值,且隨著溫度的升高猝滅速率常數(shù)降低,說明TMP對HSA猝滅機制是形成復合物的靜態(tài)猝滅,而不是由分子碰撞引起的動態(tài)猝滅。詳見表1。

表1 TMP與HSA的Stern-Volmer常數(shù)

2.2.2 TMP與HSA的結合位點數(shù)n、結合常數(shù)K的計算 在靜態(tài)猝滅作用中,熒光強度與猝滅劑的關系可由靜態(tài)猝滅公式表示:以lg(F0-F)/F對lg[Q]作圖,由直線的截距、斜率求得:298K,K=1.83×104L/mol,n=1.06,相關系數(shù) r=0.996 7;308K,K=1.58×104L/mol,n=1.05,相關系數(shù) r=0.998 5。由此推測TMP與HSA可能僅有一個結合位點。詳見圖5。

圖5 不同溫度下TM P對HSA的雙對數(shù)圖

2.2.3 TMP與HSA色氨酸殘基間的距離的計算 根據(jù)F? ster偶極-偶極非輻射能量轉移機制,結合HSA的熒光光譜和TMP的紫外吸收光譜的重疊圖[9](見圖6),求得298K和308K下兩光譜重疊區(qū)的重疊積分值分別為4.95×10-16L/(mol?s)和7.34×10-16L/(mol?s)。從而求得非輻射轉移效率E為0.0040和0.0079、臨界能量轉移距離R0為1.49nm和1.59 nm及供體和受體之間的距離r為3.74 nm和3.55 nm。

圖6 298K和308K時T MP的吸收光譜(a)與 HSA的熒光光譜(b)的重疊光譜圖

2.2.4 TM P與HSA結合的熱力學性質 藥物與蛋白的作用力主要包括氫鍵、范德華力、靜電引力、疏水作用力等。相同實驗條件下分別測定在298K和308K下TM P與HSA作用的相關熱力學參數(shù)?！鱮Hm＜0,△rSm＞0,表明TMP與HSA的相互作用力主要為靜電作用力。Ross等[10]認為△rSm＞0是疏水作用力存在的標志,因此推斷也存在一定的疏水作用力。詳見表2。

表2 TMP與HSA結合熱力學常數(shù)

2.2.5 四種金屬共存金屬離子對TMP與HSA結合常數(shù)的影響(見表3) M g2+離子的存在使TMP與HSA的結合常數(shù)減小;而Co2+、Zn2+、Cu2+離子的存在增大了 TMP與 HSA的結合常數(shù)。

表3 共存金屬離子對 TMP與HSA結合常數(shù)的影響

2.2.6 TM P對HSA構象的影響(見圖7) 酪氨酸和色氨酸殘基的熒光同時被猝滅,色氨酸殘基的熒光強度降低更多,推測TMP與HSA的結合位點更接近于色氨酸殘基。色氨酸的最大發(fā)射波長發(fā)生了藍移,酪氨酸的最大發(fā)射波長基本不變。表明TM P的加入使色氨酸殘基附近的極性降低,疏水性環(huán)境增強,說明HSA的構象發(fā)生了變化。

圖7 TM P與HSA作用的同步熒光光譜圖

3 討 論

由藥物分子的結構和疏水性可知,TM P分子脂溶性強,水溶性差。HSA的空間結構由3個結構域組成,每個結構域由2個亞結構域以槽口相對的方式形成圓筒狀結構,幾乎所有的疏水性氨基酸殘基都包埋在圓筒內部,構成疏水腔[11]。推測TMP可能主要通過靜電作用力及一定的疏水作用力結合在HSA的疏水腔內。

人體內存在許多金屬離子,當藥物進入體內后,會與這些金屬離子結合從而影響藥物與血清白蛋白的結合。由于M g2+與TMP之間存在相互競爭作用,減小了TMP與HSA的結合常數(shù),縮短TMP在血漿中的儲留時間,增大TMP的最大作用強度,適于短期內提高TMP藥效的臨床治療;而Co2+等金屬離子的存在增大了TMP與HSA的結合常數(shù),推測可能是金屬離子與TMP形成的配合物改變了TMP的性質,使TMP更容易與HSA結合[12]。從臨床醫(yī)學和藥學的角度考慮,這些金屬離子的存在使TMP在血漿中的潴留時間相應延長,釋放更緩慢,藥效更持久,減小TMP的毒性[13]。以上實驗結果為探討TMP的藥理、藥效和體內代謝機制提供了可靠的實驗數(shù)據(jù)。

[1] 任志強,孫蘭軍.川芎嗪的心血管藥理作用[J].中西醫(yī)結合心腦血管病雜志,2008,6(5):570-572.

[2] Cartery C,He X M,Munson S H,et al.Three-dimensional structure of human serum albumin[J].Science,1989,244(4909):1195-1198.

[3] Ajay KS,Samir KP.Resonance energy transfer and ligand binding studies on pH-induced folded states of human serum albumin[J].J Photochemi Photobio B:Biolo,2008,90(3):187-197.

[4] Scatchard G,Scheiberg II,Armstrong S H.Physical chemistry of protein solutions(Ⅳ):The combination of human serum albumin with chloride ion[J].J Am Chem Soc,1950,72:535-540.

[5] Bogdan M,Pirnau A,Floare C,et al.Binding interaction of indomethacin with human serum albumin[J].J Pharm Biomed Anal,2008,47:981-984.

[6] 楊頻,高飛.生物無機化學原理[M].第2版.北京:科學出版社,2002:322-331.

[7] 王麗,張愛平,楊錦艷,等.燈盞乙素與牛血清白蛋白相互作用的研究[J].中國藥物與臨床,2007,7(9):667-669.

[8] Lakowicz JR,Weber G.Quenching of fluorescence by oxygen:Probe for structural in acromolecules[J].Biochem,1973,12:4161-4170.

[9] 周能,梁逸曾,王平,等.二氫氯噻與牛血清白蛋白的相互作用特征[J].分析試驗室,2008,27(2):30-33.

[10] Ross DP,Subramanian S.Thermodynamics of protein association reactions:Forces contributing to stability[J].Biochemistry,1981,20:3096-3099.

[11] Ulrich K H.Molecular aspects of ligand binding to serum albumin[J].Pharmacol Rev,1981,33(1):17-53.

[12] 張國文,闕青民,潘軍輝.葛根素與牛血清白蛋白相互作用的研究[J].光譜學與光譜分析,2007,27(9):1784-1787.

[13] 伍欽,劉玲玲,姚培.Cu(Ⅱ),Ni(Ⅱ)存在條件下鹽酸小檗堿與牛血清白蛋白相互作用的研究[J].分析測試學報,2006,25(4):48-51.