王中琳

影響缺血性卒中神經(jīng)再生和重塑的因素主要包括促進因素和抑制因素,而抑制因素在神經(jīng)再生過程中扮演著更為重要的角色,能否有效解除抑制效應是中樞神經(jīng)再生的關(guān)鍵[1]。迄今少突膠質(zhì)細胞髓鞘糖蛋白(OMgp)是已發(fā)現(xiàn)的主要的抑制軸突生長的蛋白之一。前期研究表明[2],滋補肝腎中藥首烏仙海片可誘導缺血性卒中神經(jīng)功能重塑,促進神經(jīng)軸突的再生。本研究通過觀察首烏仙海片干預局灶性腦缺血模型大鼠腦組織中OMgp含量的變化,進一步探討中藥在腦梗死后腦功能重塑中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物和分組 雄性 SD大鼠240只,體質(zhì)量250 g～300 g,山東中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供,合格證號:魯動質(zhì)字0002342。240只大鼠隨機分為正常對照組、假手術(shù)組、模型組、藥物組,并根據(jù)腦缺血病程每組又分為3 d、1周、2周、4周、6周共5個亞組,每個亞組各為 12只。

1.1.2 藥物與試劑 首烏仙海片主要藥物有制首烏、仙靈脾、海馬、桑寄生、草決明等,由山東魯信藥業(yè)有限公司提供,批號2007030701,并按照成人劑量的20倍[9 g/(kg?d)]將其制成水溶液,濃度為0.9 g/mL(10 mL/kg),置于4℃冰箱中備用。OMgp單克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 模型制作及處理 按Longa等[3]的方法稍加改進行大腦中動脈閉塞術(shù)(MCAO)制作局灶性腦缺血模型。正常對照組:不做任何干預。假手術(shù)組:線栓插入頸內(nèi)動脈但不栓塞大腦中動脈。模型組:線栓法大腦中動脈閉塞造模,不進行藥物干預。藥物組:行線栓法大腦中動脈閉塞造模,造模成功24 h后給予首烏仙海片。MCAO模型成功的判斷標準采用Longa評分標準[3]:0分,無神經(jīng)缺損表現(xiàn);1分,對側(cè)前爪不能充分伸展;2分,向外側(cè)轉(zhuǎn)圈;3分,行走時向?qū)?cè)傾倒;4分,不能行走,意識喪失。動物清醒后進行神經(jīng)功能評分,1分～3分為納入標準,0分和4分者剔除。于造模成功24 h后給藥,藥物組灌胃給予首烏仙海片水溶液10 mL/kg,各對照組分別給予10 mL/kg蒸餾水灌胃,每日1次,每周連續(xù)給藥6 d,停1 d,并于取材當天停藥。在取材的各時間點,3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉后,4%多聚甲醛PBS灌注固定取腦,然后將其浸于4%多聚甲醛中后固定。常規(guī)脫水浸蠟包埋,予正中隆起水平在切片機上行4 μ m連續(xù)冠狀切片。

1.2.2 免疫組織化學染色 切片常規(guī)脫蠟至水;30%H2O21份+蒸餾水10份混合,室溫10 min以滅活內(nèi)源性酶,蒸餾水洗3次;熱修復抗原:將切片浸入 0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液(pH6.0),電爐加熱至沸騰后斷電,間隔10 min后,反復 1次,自然冷卻后用 PBS洗滌2次;滴加 5%BSA封閉液,室溫20 min,甩去多余液體,不洗;滴加兔抗鼠OMgp一抗(1∶50),4℃過夜,PBS(pH7.2～7.6)洗2 min×3次;滴加生物素化山羊抗兔IgG,37 ℃20 min。PBS(pH7.2～7.6)洗2 min×3次;滴加試劑SABC,37℃20 min,PBS洗 5 min×4次;DAB顯色:使用DAB顯色試劑盒,室溫顯色,鏡下控制反應時間,蒸餾水洗滌;脫水,透明,封片,顯微鏡觀察。免疫組織化學染色陰性對照用生物素化山羊抗兔IgG代替一抗,其余步驟同上,以檢查OMgp免疫反應的特異性。

1.2.3 圖像分析 切片在統(tǒng)一放大倍數(shù)下,隨機選10個視野,運用HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文報告分析系統(tǒng)進行分析,記錄平均陽性細胞數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學處理 所得數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)分布及方差齊性檢驗后進行單因素方差分析,數(shù)據(jù)用SAS 8.1版統(tǒng)計軟件進行分析。

2 結(jié) 果(見表1)

表2 各組不同時點OMgp表達比較(±s)

表2 各組不同時點OMgp表達比較(±s)

組別 3 d 1周 2周 4周 6周正常對照組 9.19±1.83 7.42±1.24 8.03±1.37 8.46±1.81 9.06±2.82假手術(shù)組 8.20±1.27 7.86±1.61 9.14±1.72 8.72±2.02 9.31±1.42模型組 18.61±2.691) 23.62±4.631) 34.04±4.801) 31.65±4.401) 25.23±4.121)藥物組 15.41±2.352) 18.81±3.692) 25.00±4.713) 19.77±3.693) 19.62±4.333)與正常對照組同時間比較,1)P＜0.01;與模型組同時間比較,2)P＜0.05,3)P＜0.01

3 討 論

中樞神經(jīng)再生失敗的主要原因是缺乏適合的微環(huán)境[4],抑制軸突再生蛋白的存在是哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)再生的主要障礙之一,其中損傷后少突膠質(zhì)細胞髓鞘來源的抑制性蛋白對軸突再生的抑制作用已成為當前軸突再生研究領(lǐng)域的熱點之一,現(xiàn)已證實OMgp對軸突再生有顯著抑制作用,對其進行有效地干預,能夠促進神經(jīng)重塑,修復缺損的神經(jīng)功能[5]。

OMgp是少突膠質(zhì)細胞和髓鞘表面的糖基磷脂酰肌醇錨定蛋白,含有433個氨基酸殘基。1990年研究人員用編碼OM gp的cDNA克隆篩選人基因組DNA文庫,得到了人OMgp基因。通過基因組克隆與分裂中期細胞雜交,將人的OMgp基因定位于17號染色體的q11～12處[6]。進一步的研究結(jié)果顯示,OMgp基因是 NF1基因的一個內(nèi)含子,過表達 OMgp的NIH3T3細胞生長速度明顯減緩,細胞周期分析發(fā)現(xiàn)細胞在G1期受阻,OMgp可阻礙有絲分裂信號途徑而發(fā)揮生長抑制作用[7],證明了OM gp作為髓鞘相關(guān)蛋白能抑制軸突生長,導致生長錐的坍塌。體外培養(yǎng)條件下OM gp對多種神經(jīng)細胞均有生長抑制作用,如大鼠海馬神經(jīng)元、小腦顆粒細胞、視神經(jīng)節(jié)細胞以及NG108和PC12細胞系等,將OMgp和背根神經(jīng)節(jié)共培養(yǎng)可觀察到明顯的生長錐崩解現(xiàn)象[8]。Benxiu等[9]通過對OMgp基因敲除的大鼠脊髓損傷后神經(jīng)再生的觀察,發(fā)現(xiàn)其軸突再生及神經(jīng)功能的恢復較野生型大鼠差異有統(tǒng)計學意義,進一步明確了OMgp對軸突再生的顯著抑制。

本實驗發(fā)現(xiàn),大鼠腦梗死后其腦組織內(nèi)OMgp在早期即成高表達,并逐漸增高,于2周時達到高峰,2周后逐漸下降,但直至6周時表達也明顯高于正常對照組,且各時相OMgp的表達與正常對照組比較有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)?？梢奜M gp在腦梗死后較長時間處于高表達狀態(tài),這可能是中樞神經(jīng)損傷后再生困難的一個主要原因。

近年來有關(guān)中藥誘導中樞神經(jīng)再生的研究均是著眼于促進神經(jīng)生長正性調(diào)節(jié)因子的表達,而對能否下調(diào)抑制因素的表達則鮮有報道。中醫(yī)學認為,腦梗死的發(fā)生病機關(guān)鍵為肝腎虧虛,其治療也當立足調(diào)補肝腎。首烏仙海片由何首烏、仙靈脾、海馬等組成,此方補腎精以生髓,補肝木以養(yǎng)春生之氣,意在生髓以充腦。本研究探討首烏仙海片對腦梗死模型大鼠OMgp表達的影響,結(jié)果表明,藥物組大鼠腦梗死后OMgp在各時相的表達均顯著低于同期模型組,說明首烏仙海片可通過抑制神經(jīng)生長負性調(diào)控因子的表達對腦梗死后的神經(jīng)發(fā)生有促進作用。

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