賈立昕,李俊男,邊云飛,劉改珍,肖傳實(shí)

冠心病是一種多基因遺傳因素和環(huán)境因素共同作用導(dǎo)致的疾病,對(duì)不同人種人群易感基因的篩選工作是基因功能研究的基礎(chǔ),也是基因診斷和治療的基礎(chǔ)。腎上腺素能β2受體屬于G-蛋白耦聯(lián)受體超家族,其信號(hào)通路在心血管疾病和代謝疾病方面都發(fā)揮重要作用[1]。已有研究證實(shí)在動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程中,β2受體對(duì)于人類心臟冠狀動(dòng)脈的舒張有重要的調(diào)節(jié)作用[2]。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在β2受體的編碼基因中存在眾多具有高度遺傳異質(zhì)性的單核苷酸突變位點(diǎn)(SNP),體外實(shí)驗(yàn)證實(shí),一些SNP改變可以引起編碼氨基酸的改變(錯(cuò)義突變),而使β2受體對(duì)腎上腺素能藥物刺激的反應(yīng)性發(fā)生改變[3]。其中+46A/G(Arg16Gly)rs1042713、+79G/C(Gln27GlU)rs1042714 和 +491C/T(Thrl64Ile)rs1800888,是最常見的 3個(gè) SNP變異。

已有多項(xiàng)研究表明β2受體基因(ADRB2)SNP位點(diǎn)與冠心病密切相關(guān),但在不同人群中的研究結(jié)果卻并不完全一致[4-8]。因此,在ADRB2基因的遺傳變異和冠心病發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性值得繼續(xù)深入研究,目前國(guó)內(nèi)尚未見相關(guān)報(bào)道。本研究將選取+46A/G(Arg16Gly)rs1042713位點(diǎn)進(jìn)行研究,在山西漢族人群中探討其與冠心病的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院2008年1月—2009年8月心內(nèi)科住院治療的冠心病患者428例,全部為經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影證實(shí)的冠心病患者。診斷符合1979年WHO頒布的缺血性心臟病診斷標(biāo)準(zhǔn)。其中男317例,女111例,年齡(59.99±10.63)歲。對(duì)照組為經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影證實(shí)無(wú)冠心病的其他病患者,共397例,其中男254例,女 143例,年齡(53.20±10.47)歲。所有入選對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2 調(diào)查內(nèi)容 個(gè)人的一般情況、既往疾病史、疾病家族史、吸煙飲酒史;身高、體重等體格檢查,并計(jì)算體重指數(shù);測(cè)定血糖、血脂等各項(xiàng)生化指標(biāo)。血標(biāo)本的采集:研究對(duì)象均在抽血前嚴(yán)格禁食12 h,采集靜脈血備用。

1.3 外周血白細(xì)胞DNA的制備 5 mL外周血以0.5 mol/L EDTA-Na2抗凝后,經(jīng)過(guò)常規(guī)鹽析、酚-氯仿法提取外周血白細(xì)胞基因組DNA。

1.4 基因型鑒定 基因型鑒定是由上海翼和應(yīng)用生物技術(shù)有限公司采用連接酶檢測(cè)法(ligase detection reactions,LDR)完成。采用多重PCR技術(shù)對(duì)包含rs1042713目的DNA序列進(jìn)行擴(kuò)增。上游引物:5'-GCTCACCTGCCAGACTGC-3',下游引物:5'-GACCAGCACATTGCCAAAC-3'。在PCR擴(kuò)增結(jié)束后采用3%瓊脂糖凝膠電泳觀察PCR產(chǎn)物的效果,以確定其作為模板在 LDR反應(yīng)中加入的量。LDR的反應(yīng)體系10 μ L,反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性2 min后;94℃30 s,50℃2 min,35個(gè)循環(huán)。LDR反應(yīng)的熒光產(chǎn)物通過(guò)ABI PRISM 377 DNA Sequencer進(jìn)行分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,基因型和等位基因頻率比較采用卡方檢驗(yàn),計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 ADRB2基因多態(tài)性位點(diǎn)rs1042713位點(diǎn)基因型的判斷通過(guò)多重PCR擴(kuò)增目的DNA,3%瓊脂糖凝膠電泳顯示擴(kuò)增產(chǎn)物(見圖1)。經(jīng)ABI PRISM 377 DNA Sequencer分析,在所調(diào)查的人群中可檢出3種 rs1042713的基因型,分別是A/A型、G/G型和 A/G型。A/A和G/G基因型分別在 sz90.48和sz90.70處出現(xiàn)單一波峰,而A/G基因型則在sz89.77和sz91.70處出現(xiàn)雙峰(見圖2)。

2.2 ADRB2基因rs1042713多態(tài)性位點(diǎn)等位基因和各基因型頻率的分布 ADRB2基因rs1042713位點(diǎn)多態(tài)性的基因頻數(shù)分布符合Hardy-Weinberg平衡(P＞0.05)。其基因型和等位基因頻率的分布見表1,以顯性遺傳模式分析發(fā)現(xiàn)A等位基因型頻率顯著低于對(duì)照組(45.8%vs56.7%,P=0.002,OR=1.548)。

表2 ADRB2基因rs1042713多態(tài)性位點(diǎn)等位基因和各基因型頻率的分布

3 討 論

本研究在山西漢族人群中對(duì)ADRB2基因變異與冠心病的關(guān)系進(jìn)行了探討。β2受體是交感神經(jīng)系統(tǒng)的重要組成部分,在體內(nèi)各種組織均有不同程度表達(dá),包括心肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、支氣管平滑肌細(xì)胞等,并參與調(diào)節(jié)心率、血壓、呼吸等多種生理功能。β2受體在冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞上均有表達(dá)[9-11],且能引起正常冠狀動(dòng)脈的微循環(huán)血管的舒張。同時(shí)已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)在動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程中,β2受體對(duì)于人類心臟冠狀動(dòng)脈的舒張有重要調(diào)節(jié)作用[2]。人類β2-AR基因(ADRB2)位于5號(hào)染色體長(zhǎng)臂3區(qū) 1帶和2帶之間(5q31～5q3Z),大多數(shù)哺乳動(dòng)物(包括人類)β2-A R基因無(wú)內(nèi)含子,只有一個(gè)外顯子,共編碼413個(gè)氨基酸殘基[12]。其最常見的3個(gè)SNP變異+46A/G(Arg16Gly)rs1042713、+79G/C(Gln27GlU)rs1042714和+491C/T(Thrl64Ile)rs1800888,均位于編碼區(qū)。

以往對(duì)β2受體基因多態(tài)性與冠心病的相關(guān)性研究尚無(wú)定論。Khahd等對(duì)沙特阿拉伯人 rs1042714位點(diǎn)的研究表明,雜合子C/G和純合子G/G是沙特阿拉伯人冠心病的獨(dú)立危險(xiǎn)因子[4]。而M axwell等[5]發(fā)現(xiàn)不同種族β2-AR基因的雜合子C/G和純合子G/G的基因型頻率不同。Piscione等[6]對(duì)330例冠心病患者Thrl64Ile位點(diǎn)的關(guān)聯(lián)性研究結(jié)果顯示,該位點(diǎn)與冠心病相關(guān),同時(shí)進(jìn)行36個(gè)月的隨訪,發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)的突變還與冠心病的預(yù)后密切相關(guān)。Yamada等[7]在對(duì)日本患者的研究中發(fā)現(xiàn)β2受體基因的突變會(huì)使心肌梗死發(fā)病率增高。同樣這一結(jié)果也在歐洲人群中得到證實(shí)[8]。

在本次實(shí)驗(yàn)中,選取了山西漢族人群檢測(cè)ADRB2基因rs1042713位點(diǎn)在冠心病及對(duì)照組中的基因型分布,發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)A/G多態(tài)性與冠心病的發(fā)病密切相關(guān),并以顯性遺傳模式分析,發(fā)現(xiàn)在冠心病病例組中ADRB2基因rs1042713位點(diǎn)A等位基因型頻率顯著低于對(duì)照組,A等位基因可能是山西漢族人群冠心病的保護(hù)因素之一。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)尚有不足之處,主要有:①本實(shí)驗(yàn)的病例均來(lái)自于臨床診治機(jī)構(gòu),未能全面的反應(yīng)該位點(diǎn)在所代表人群中的分布狀況;②樣本量有待進(jìn)一步擴(kuò)大。

總之,本研究首次在山西漢族人群中研究了ADRB2基因的遺傳變異與冠心病的相關(guān),對(duì)進(jìn)一步理解冠心病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制以及其防治提供了新的線索。

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