陳建，王賀，林久茂，鄭良樸，郝萬山（.福建中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，福建福州5008；.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建福州5008；.北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京0009）

柴桂溫膽定志湯對抑郁模型大鼠海馬BDNF和TrκB的影響

陳建1，王賀1，林久茂2，鄭良樸2，郝萬山3
（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，福建福州350108；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建福州350108；3.北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京100029）

目的觀察柴桂溫膽定志湯對抑郁模型大鼠海馬腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）和特異性受體酪氨酸激酶B（TrκB）的影響。方法將42只SD大鼠隨機(jī)分為6組，采用長期輕度不可預(yù)見性應(yīng)激加孤養(yǎng)復(fù)制大鼠抑郁癥模型，運(yùn)用免疫組織化學(xué)法測定大鼠海馬BDNF及其TrκB的表達(dá)。結(jié)果模型組大鼠海馬BDNF和TrκB的表達(dá)明顯低于空白對照組（P＜0.01）；氟西汀組、柴桂溫膽定志湯高劑量組大鼠海馬BDNF和TrκB的表達(dá)皆明顯高于模型組（P＜0.01）；柴桂溫膽定志湯中劑量組大鼠海馬BDNF和TrκB的表達(dá)高于模型組（P＜0.05）。結(jié)論柴桂溫膽定志湯能提高抑郁模型大鼠海馬BDNF及其受體TrκB的表達(dá)，從而保護(hù)海馬神經(jīng)元，可能是其抗抑郁的藥理機(jī)制之一。

抑郁癥；海馬；腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子；酪氨酸激酶B；柴桂溫膽定志湯

抑郁癥是臨床的疑難病，中西醫(yī)治療都頗為棘手，隨著生活與工作壓力的加大，發(fā)病率有逐漸上升的趨勢。北京中醫(yī)藥大學(xué)郝萬山教授在臨床中反復(fù)摸索，創(chuàng)立了柴桂溫膽定志湯，用于抑郁癥的治療，取得了良好的效果。筆者在前期研究基礎(chǔ)上，采用長期輕度不可預(yù)見性應(yīng)激加孤養(yǎng)復(fù)制抑郁癥大鼠模型，通過觀察大鼠海馬BDNF和TrκB表達(dá)的變化，探討柴桂溫膽定志湯對抑郁模型大鼠海馬神經(jīng)元的影響，以期闡釋該方的抗抑郁機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 藥物鹽酸氟西汀膠囊［20 mg／片，Patheon France（法國），批號：8147A］。柴桂溫膽定志湯組成：柴胡10 g，黃芩10 g，桂枝10 g，赤芍10 g，白芍10 g，半夏10 g，生姜10 g，陳皮10 g，枳殼10 g，竹茹10 g，茯苓20 g，人參5 g，石菖蒲6 g，遠(yuǎn)志10 g，大棗5枚，炙甘草6 g。中藥飲片由福建中醫(yī)藥大學(xué)國醫(yī)堂提供。

1.1.2 試劑多聚賴氨酸；BDNF抗體（美國SANTACRUZ公司，批號：B0626）；TrκB抗體（美國SANTA CRUZ公司，批號：D0809）；SP試劑盒（河北博海生物工程開發(fā)有限公司，批號：701323A）；DAB染色試劑盒（河北博海生物工程開發(fā)有限公司，批號：673767A）等。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動物清潔級成年SD大鼠42只，雌雄各半，體重（200±20）g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供，動物合格證號：0054756。

1.1.4 主要儀器顯微鏡（日本奧林巴斯，BX51TPHD-J11）；多功能真彩色細(xì)胞圖象分析管理系統(tǒng)（美國Media Cybernetics公司，Image-Pro Plus）；切片機(jī)（德國萊卡，RM2015）等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動物分組大鼠購進(jìn)后，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，隨機(jī)分為6組，每組7只，即正常對照組（NC組）、模型對照組（MC組）、氟西汀組（FC組）、柴桂溫膽定志湯高劑量組（CG組）、柴桂溫膽定志湯中劑量組（CZ組）、柴桂溫膽定志湯低劑量組（CD組）。

1.2.2 造模參照文獻(xiàn)［1］，空白組自由飲水?dāng)z食，不予任何刺激。其余各組大鼠1只／籠，孤養(yǎng)。自分組之日起，連續(xù)給予21 d各種未預(yù)知的應(yīng)激，包括24 h禁食，24 h禁水，通宵照明，4℃冷水游泳5 min，40℃烘箱熱烘5min，夾尾1min，100伏電擊足底1min，懸尾1 min等刺激。每日從以上的刺激中隨機(jī)選擇1種，順序隨機(jī)，使動物不能預(yù)知給予的刺激，制備抑郁癥大鼠模型。

1.2.3 給藥氟西汀以蒸餾水配制成濃度為0.18 mg／mL的藥液；柴桂溫膽定志湯分別以蒸餾水配置成3.156，1.578，0.789 g／mL高、中、低3種濃度的藥液，備用。每組動物于每日上午9：30灌胃，正常對照組和模型對照組每次分別灌服生理鹽水10mL／kg；氟西汀組灌服氟西汀藥液10mL／kg；中藥各劑量組分別灌服相應(yīng)濃度藥液10 mL／kg。人與大鼠用藥量換算參考文獻(xiàn)方法［2］，各組灌藥量均為70 kg成人的等效劑量。在給予應(yīng)激的第1 d開始灌胃，連續(xù)21 d，每日1次。

1.2.4 取材6組大鼠于實(shí)驗(yàn)結(jié)束的第2 d斷頭處死，大鼠麻醉后開胸，升主動脈插管，生理鹽水沖洗后，繼續(xù)灌注4%多聚甲醛，取腦后固定，蔗糖內(nèi)梯度脫水，浸蠟，石蠟包埋，切片，取海馬與齒狀回互包平面，切片厚度5μm。

1.2.5 免疫組織化學(xué)法測定大鼠海馬BNDF、TrκB的表達(dá)情況將組織切片附于經(jīng)多聚賴氨酸附膜的載玻片上，60℃過夜；常規(guī)脫蠟至水；1%甲醇雙氧水，室溫10min，蒸餾水洗1次，0.1MPBS洗3次×5 min；切片上滴加抗原修復(fù)液，室溫10 min，0.1MPBS洗3次，5min；切片上滴加正常山羊血清封閉液，室溫20min。甩去多余液體，不洗。切片上滴加第一抗體，4℃過夜，0.1 MPBS洗3次，5min。切片上滴加生物素化第二抗體（IgG），37℃20min，0.1MPBS洗3次，5 min；切片上滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液（S-A／HRP），37℃20min，0.1MPBS洗3次，5 min；DAB顯色：使用DAB顯色試劑盒1 mL蒸餾水加顯色劑A、B、C各1滴，混勻，加至標(biāo)本上，顯色6 min，充分水洗；蘇木素輕度復(fù)染。脫水，透明，封片。顯微鏡觀察并拍片。

1.2.6 免疫組織化學(xué)染色半定量分析采用Image Pro Plus多功能真彩色細(xì)胞圖象分析管理系統(tǒng)，對照大鼠腦立體定位圖譜，選擇實(shí)驗(yàn)組和對照組的陽性和陰性組織相。每張切片選擇5個互不重疊的視野，在400倍光鏡下分別測量各個視野的BDNF和TrκB陽性細(xì)胞數(shù)，用單位面積陽性細(xì)胞記數(shù)和總細(xì)胞數(shù)的百分比表示該成分的相對含量，取其平均值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析使用SPSS 13.0軟件包對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示，組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1，圖1，圖2。

表1 各組大鼠海馬BDNF和TrκB相對含量比較（ˉx±s）

2.1 對大鼠海馬BDNF表達(dá)的影響光鏡下可見BDNF和TrκB免疫組織化學(xué)陽性細(xì)胞在海馬區(qū)主要集中干CA1和CA3區(qū)錐體細(xì)胞和DG顆粒細(xì)胞，二者的陽性反應(yīng)存在于細(xì)胞胞漿中，胞核不染色。與NC組相比，MC組大鼠海馬的BDNF免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元數(shù)目明顯減少，有顯著意義（P＜0.01）；與MC組相比，F(xiàn)C組大鼠海馬的BDNF免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元數(shù)目明顯增加，有顯著意義（P＜0.01），CG、CZ組大鼠海馬的BDNF免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元數(shù)目明顯增加，有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01、P＜0.05）；CG組與FC組相比較，無統(tǒng)計學(xué)意義；中藥高、中劑量組相比較，無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2 對大鼠海馬TrκB表達(dá)的影響結(jié)果顯示，與NC組比較，MC組大鼠海馬TrκB免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元數(shù)目明顯減少，有顯著意義（P＜0.01）；與MC組相比，F(xiàn)C組大鼠海馬的TrκB免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元數(shù)目明顯增加，有顯著意義（P＜0.01），CZ、CG組大鼠海馬的TrκB免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元數(shù)目明顯增加，有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05、P＜0.01）；CG組與FC組相比較，無統(tǒng)計學(xué)意義；中藥高、中劑量組相比較，無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 各組大鼠海馬BDNF免疫組化染色

圖2 各組大鼠海馬TrκB免疫組化染色

3 討論

抑郁癥的病人往往有情緒低落、興趣減低、思維遲鈍、乏力等癥狀。臨床觀察到，病人乏力的癥狀往往有晨重暮輕的特點(diǎn)，與少陽病的發(fā)病特點(diǎn)頗相吻合。少陽為“小陽”，屬木行，其陽氣生發(fā)于清晨。若少陽陽氣不足，生發(fā)無力，則乏力多表現(xiàn)為晨重暮輕；清陽升發(fā)無力，腦竅失充，加之痰濁乘虛上擾，清竅受阻，則思維遲鈍。少陽疏泄失職，情志不暢，則見抑郁、心情低落?？梢娨钟舭Y的病機(jī)與膽陽不足、膽失疏泄、痰濁阻竅有關(guān)。柴桂溫膽定志湯由經(jīng)方柴胡桂枝湯、溫膽湯以及《千金要方》中的定志小丸組合而成，有疏肝利膽、溫陽升清、滌痰開竅等功效，用于抑郁癥的治療，效果良好。

長期輕度不可預(yù)見性應(yīng)激加孤養(yǎng)復(fù)制的抑郁癥模型能較真實(shí)地模擬抑郁癥的某些癥狀和病因，已成為國內(nèi)外學(xué)者探究抑郁癥的發(fā)病機(jī)制及抗抑郁劑作用機(jī)理而廣泛應(yīng)用的動物模型。筆者在此模型的基礎(chǔ)上，初步研究柴桂溫膽定志湯的抗抑郁藥理機(jī)制。

抑郁癥的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，有研究表明抑郁癥的發(fā)生與海馬區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞的萎縮和壞死有關(guān)，神經(jīng)元可塑性失調(diào)與抑郁癥的發(fā)病關(guān)系密切［3］。BDNF是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族中的重要成員，是一種具有防止神經(jīng)元死亡功能的蛋白質(zhì)，其表達(dá)水平的下降參與抑郁癥的某些生理、病理過程，可能是抑郁癥的基本病理改變之一。TrκB是BDNF特異性高親和力受體，廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，對神經(jīng)元的生存、生長、分化有重要的影響［4］。研究表明通過高親和力受體TrκB介導(dǎo)，BDNF能促進(jìn)突觸的可塑性，包括增加突觸終末的密度，促進(jìn)樹突和軸突的長出，直接參與調(diào)節(jié)學(xué)習(xí)和記憶過程［5］?？梢夿DNF／TrκB信號傳導(dǎo)通路在維持神經(jīng)元細(xì)胞的存活、生長及分化等方面發(fā)揮著重要作用［6］。

研究結(jié)果顯示，模型組大鼠海馬BDNF和TrκB的表達(dá)明顯下降，柴桂溫膽定志湯高、中劑量組不同程度地提高大鼠海馬BDNF和TrκB的表達(dá)。表明慢性應(yīng)激時大鼠海馬BDNF和TrκB的表達(dá)降低，BDNF／TrκB信號傳導(dǎo)通路失常是抑郁癥發(fā)病機(jī)制的重要環(huán)節(jié)。提高海馬BDNF及其受體TrκB的表達(dá)，進(jìn)而對海馬神經(jīng)元可塑性進(jìn)行調(diào)節(jié)，保護(hù)海馬神經(jīng)元可能是柴桂溫膽定志湯的抗抑郁藥理機(jī)制之一。當(dāng)然在柴桂溫膽定志湯的抗抑郁過程中，BDNF是如何通過TrκB的介導(dǎo)而達(dá)到保護(hù)海馬神經(jīng)元作用的，其深入的機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

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R285.5

A

1007－4813（2010）05－0643－03

2010－07－07）

福建省科技廳青年人才資助項(xiàng)目（2007F3044）。

陳建（1974－），男，醫(yī)學(xué)博士，副教授。研究方向：經(jīng)方辨治情志病癥的臨床與實(shí)驗(yàn)研究。