陳菊萍 馬 櫻 羅志娟 魏大鵬 (揚州大學第二臨床醫(yī)學院皮膚性病科,揚州 225001)

色素減退性疾病白癜風是嚴重影響患者生活質量的一種疾病,其發(fā)病機制目前未完全明了,許多研究表明可能和自身免疫有很大關系[1-5],但自身免疫是初始原因還是繼發(fā)原因,一直未有定論,也有研究表明和遺傳、自由基對細胞的損傷等有關。

本實驗通過制備兔抗B16黑素細胞多克隆抗體,利用免疫組織化學和 Western blot鑒定多克隆抗體;并通過親和層析法純化抗血清,得到IgG,檢測其對黑素細胞增殖的影響,為進一步研究此抗體對黑素細胞生長及色素代謝的影響奠定基礎,從另一方面探討免疫因素特別是自身免疫在色素減退性疾病白癜風發(fā)病機制中所起的作用,為尋找白癜風的動物模型打下了基礎。

1 材料和方法

1.1 材料 健康家兔,雄性,體重2 kg,四川大學華西實驗動物中心提供。B16黑素細胞購自中國科學院上海生命科學研究所,辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG,生物素化山羊抗兔IgG等試劑購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 B16黑素細胞培養(yǎng)、收集、爬片及固定 B16黑素細胞復蘇后,使用含10%小牛血清的1640培養(yǎng)基于37℃、5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)。收集對數生長期的黑素細胞,接種入6孔板,每孔加入4%多聚甲醛1 ml,固定后室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 B16黑素細胞顆粒性抗原免疫家兔 經75%酒精固定后的B16黑素,Hank's液離心清洗細胞,最后用生理鹽水懸勻成5×107ml-1免疫用B16黑素細胞混懸液。經家兔耳緣靜脈注射B16免疫用黑素細胞混懸液1.0ml做第一次免疫。第7天同樣方法第二次免疫家兔;第14天家兔耳緣靜脈采血0.5 ml,凝集實驗測血清抗B16黑素細胞抗體效價。第14天同樣方法耳緣靜脈注射B16黑素細胞懸液0.5 ml第三次免疫家兔;第20天家兔耳緣靜脈采血0.5 ml,凝集實驗測血清抗B16黑素細胞抗體效價。第20天同樣方法耳緣靜脈注射B16黑素細胞懸液0.5 ml第四次免疫家兔;以后分別于第23天、25天,第5次、第6次免疫和采血測定抗體效價。

1.2.3 家兔血清抗B16黑素細胞抗體效價測定-試血(試管凝集實驗) 免疫三次(14天)后、四次(20天)后、免疫五次(23天)后,免疫六次(25天)后,試管凝集法分別測家兔血清抗體效價。具體方法為:分別取家兔耳緣靜脈血、家兔心臟血、頸動脈血經靜置,凝固,血清析出,離心,取上層血清稀釋后加入U型微量反應板中,不加血清而加等量生理鹽水(N.S)者作為N.S對照。將B16黑素細胞懸液加入上述U型微量反應板中,37℃孵育45分鐘后觀察結果。

1.2.4 B16黑素細胞爬片免疫組織化學(IHC)—SP法 B16黑素細胞爬片經4%多聚甲醛固定后,用SP法進行免疫組織化學,一抗為 1∶200、1∶500、1∶1 000倍稀釋的上述所獲不同免疫次數后家兔抗B16黑素細胞全血清。二抗工作液,即生物素化二抗工作液(IgG/Bio)(生物素標記山羊抗兔IgG北京中杉金橋生物技術有限公司提供,即用型),三抗為辣根過氧化物酶標記鏈霉卵白素工作液(S-A/HRP)(北京中杉金橋生物技術有限公司提供,即用型)。DAB顯色后鏡檢。

1.2.5 B16黑素細胞裂解液 Western blot檢測 取變性處理后的B16黑素細胞裂解液樣品,每泳道加入50 μ l,30 mA恒流SDS-PAGE電泳。電泳結束后轉N.C膜,5%脫脂奶粉封閉液封閉,分別加入一抗溶液即上述所獲不同免疫次數后家兔抗B16黑素細胞全血清(稀釋 1∶10、1∶100、1∶200、1∶500、1∶1 000倍),二抗工作液即生物素化山羊抗兔IgG(H+L)(北京中杉金橋生物技術有限公司提供),三抗工作液:PBS-T 1∶1 000倍稀釋的辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素工作液。DAB顯色。檢測結果。

1.2.6 親和層析法純化兔抗B16黑素細胞抗血清及蛋白質含量的測定

綜上所述，本文研究的結果為康復醫(yī)學工作者在為患者康復訓練時肘關節(jié)活動度達到日常生活所需即為適合的活動角度。使康復醫(yī)學工作者在為肘關節(jié)功能障礙的患者康復訓練時提供一定的指導。若患者在做某項功能性動作上有困難，則要把評估和治療這個過程放到康復訓練中來；同樣的，若患者已經知道肘關節(jié)的活動度不足，治療師和康復醫(yī)師就要預知患者在做相對的功能性動作時有困難，并且要建議做適當的調試，沒有必要一味的去追求肘關節(jié)活動度的完全恢復。

1.2.6.1 抗血清的純化、透析及濃縮 活化載體及偶聯蛋白:購買時已經完成。利用瓊脂糖珠(Protein G sepharose 4 fast flow)進行親和層析。經透析、濃縮,收集第一峰非IgG及第二峰IgG。

1.2.6.2 紫外(UV)吸收測定法測定第一峰及第二峰蛋白質含量 應用752型紫外光柵分光光度儀,選用光程為1 cm的石英比色杯,在280 nm波長處分別測定各管(未純化抗血清,純化第一峰即非IgG,純化第二峰即IgG)溶液的A280值。繪制標準曲線,得到回歸方程。按照標準曲線及方程,分別求得其蛋白質的濃度。

1.2.7 全血清及非IgG、IgG SDS-PAGE變性/非變性電泳 將樣品1:未純化兔抗B16黑素細胞抗血清;樣品2:收集第一峰即非 IgG;樣品 3:第二峰(IgG),用于變性電泳;樣品4:第二峰(IgG),用于非變性電泳。處理后按1.2.5的方法上樣及電泳。于1 mg/ml的考馬司亮藍中染色3小時。脫色:染色結束后,取出分離膠置于脫色液中,室溫脫色過夜。觀察結果。

1.2.8 MTT比色法檢測全血清、非IgG及IgG對B16黑素細胞增殖的影響 在96孔細胞培養(yǎng)板中分別加入全血清、非IgG及IgG,用正常兔IgG和非IgG為對照,再分別加入B16黑素細胞懸液100 μ l,均為3復孔,重復2次。37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。在培養(yǎng) 24、48、72小時每孔加入 5 mg/ml的MTT 10 μ l,37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4小時,每孔加入二甲基亞砜(DMSO)100 μ l,輕輕振搖20分鐘,使結晶盡量完全溶解。ZS-3型板式酶標儀測570 nm各孔吸光值。

1.3 統(tǒng)計學分析 使用SPSS 11.5軟件,用重復測量方差分析檢驗,以P＜0.05,有顯著性差異,數據使用±s。

2 結果

2.1 兔抗B16黑素細胞抗血清效價檢測結果 見表1,以B16黑素細胞懸液作為顆?？乖浖彝枚o脈分別免疫14天后,用試管凝集法測抗血清效價達1∶80;20天和23天后分別測其效價高達1∶1 280,此時抗B16黑素細胞多克隆抗體效價以達到較高水平,提示可以進行抗血清收集。

B16黑素細胞爬片的免疫組化顯示在兔抗B16黑素細胞抗血清 1∶200、1∶500、1∶1 000 倍稀釋時,均可見細胞漿內有明顯的棕黃色顆粒,突觸中也可見細小的陽性顆粒;而陰性對照中胞漿仍未淺藍色,未出現陽性顆粒,說明免疫所得的抗血清效價較高,如圖1。

2.3 B16黑素細胞裂解液 Western blot檢測結果

選擇兔抗B16黑素細胞抗血清即一抗稀釋度為1∶500,生物素化二抗稀釋度為1∶1 000,做B16黑素細胞裂解物的 Western blot檢測。檢測結果見圖2。圖中可見蛋白條帶較多,說明所制備的抗血清是抗B16黑素細胞胞漿中多種蛋白成分的多克隆抗體。

2.4 親和層析法純化兔抗B16黑素細胞抗血清結果 利用瓊脂糖珠(G protein)親和層析法將兔抗B16黑素細胞多克隆抗體純化,可見兩個明顯的吸收峰,第一峰為非IgG雜蛋白吸收峰,第二峰即洗脫峰是純化所得抗體IgG(圖未列出)。

2.5 紫外(UV)吸收測定法測定非IgG及IgG蛋白質含量 結果表明抗血清純化效果較好,濃度均達到預期值(數據未列出)。

圖1 免疫組化分析抗血清效價(20×20)Fig.1 Expression of titer antiserum by IHC(20×20)

圖2 Western blot分析B16黑素細胞胞漿中蛋白的表達Fig.2 Expression of protein in B16 melanocyte plasma by Western blot

2.6 全血清及非IgG、IgG的SDS-PAGE變性/非變性電泳結果 SDS-PAGE結果顯示全血清即未純化抗血清蛋白條帶較多,包括分子量 116.0、66.2、45.0、35.0、25.0 kD的蛋白條帶;非IgG則主要包括分子量116.0、45.0、35.0 kD的蛋白條帶;變性 IgG包括分子量66.2、35.0、25.0 kD的蛋白條帶,其中66.2 kD處有兩條條帶,非變性IgG在66.2 kD處僅一條條帶(如圖3)。

圖3 全血清及非IgG、IgG的 SDS-PAGE變性/非變性電泳Fig.3 Expression of protein by SDS-PAGE

圖4 MTT法檢測各組分對B16黑素細胞增殖的影響Fig.4 The effect of composition of antiserum on B16 melanocyte proliferation by MTT

表1 B16黑素細胞免疫家兔后第14天、第20天、第23天檢測抗血清效價結果Tab.1 the titer of the antiserum immuned by B16 melanocytes after 14,20,23 days

2.7 MTT比色法檢測全血清、非IgG和IgG對B16黑素細胞增殖的影響結果 用重復測量方差分析法,得P=0.012＜0.05,IgG組與其余兩組相比,對B16黑素細胞增殖的影響差異顯著(如圖4)。

3 討論

白癜風是一種常見的色素減退性疾病,表現為皮膚或粘膜因為黑素細胞的缺失而導致的后天性色素減退,其確切的發(fā)病機制至今未完全清楚,有學者研究發(fā)現[6-8],白癜風患者中自身免疫性疾病的發(fā)生率明顯高于正常人,白癜風患者易合并甲狀腺炎、糖尿病、風濕性關節(jié)炎、斑禿及銀屑病等等與自身免疫有關的疾病,其血清中存在多種自身抗體和細胞免疫異?，F象,如IgC、IgA、IgM 均顯著高于正常人,皮損直接免疫熒光檢查可見表皮基底膜有IgG和C3沉積,白癜風患者血清中抗黑素細胞抗體陽性率高達50%～93%,從白癜風的皮損中我們也發(fā)現有T淋巴細胞的浸潤[9,10],這些都證明白癜風與體液免疫和細胞免疫有關,但免疫異常究竟是初始原因還是繼發(fā)的反應一直未有定論。也有學者進行了流行病學調查,發(fā)現白癜風患者的一級親屬中自身免疫性疾病的發(fā)病率明顯高于正常人群,并發(fā)現了一些易感基因[11-13]。近幾年也有學者認為,H2O2及其代謝產物介導了一些抗氧化酶特別是過氧化氫酶、硫氧還蛋白還原酶、谷胱甘肽過氧化物酶、谷胱甘肽還原酶、超氧歧化酶等的改變,H2O2介導的氧化使許多蛋白功能喪失,從而引發(fā)色素代謝異常,而H2O2的產生可能與一些免疫異常有關,認為免疫異常是初始原因,H2O2的產生是繼發(fā)的[14-20],但是由于缺乏很好的動物模型,白癜風的發(fā)病機制至今未完全清楚。

本實驗采用B16黑素細胞懸液作為顆?？乖?經家兔耳緣靜脈注射,使其產生抗B16黑素細胞的多克隆抗體,即抗血清,并經純化得到IgG,觀察IgG對B16黑素細胞生長及色素代謝的影響。在體外實驗中,我們利用MTT比色法分別檢測全血清、非IgG、IgG對B16黑素細胞增殖的影響。結果表明IgG組與其余兩組相比,對B16黑素細胞生長抑制作用差異顯著,啟發(fā)我們在體內實驗時,可以將三組分別注射入小鼠皮膚,從肉眼、免疫組化等多方面觀察皮膚色素的變化,此實驗為進一步研究IgG對黑素細胞色素代謝的影響、IgG對黑素細胞細胞毒試驗、誘導黑素細胞凋亡、對黑素細胞酪氨酸酶及相關蛋白表達的影響奠定了基礎,進一步證明了自身免疫因素在色素減退性疾病白癜風發(fā)病機制中起了一定的作用。

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