黃國(guó)祥 王玉忠 周文斌 肖 波 吳志國(guó) 梁靜慧 (中南大學(xué)湘雅醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,長(zhǎng)沙 410008)

實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)是一種主要由CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的、以中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central nervous system,CNS)炎性脫髓鞘性為特征的自身免疫性疾病,因其與多發(fā)性硬化(Multiple sclerosis,MS)有著相似的臨床及病理表現(xiàn)而成為研究MS的理想模型,其具體發(fā)病機(jī)制目前尚未明確。

Th17細(xì)胞是新近發(fā)現(xiàn)的輔助性CD4+T細(xì)胞,它通過分泌IL-17A(即 IL-17)、IL-17F和TNF-α等因子而發(fā)揮促炎作用。IL-17作為IL-17家族的代表性因子,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在EAE中表達(dá)升高,IL-17-/-小鼠對(duì)EAE不敏感[1]。IL-23是IL-12家族新成員,由p19和p40兩個(gè)亞基組成,其中p40亞基為IL-12和IL-23兩者所共有。研究發(fā)現(xiàn),IL-23對(duì)于維持Th17細(xì)胞的功能具有重要的作用,而IL-23參與的Th17細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)即IL-23/Th17炎癥軸被認(rèn)為在自身免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展中起了至關(guān)重要的作用[2]。

早有研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(Transforming growth factor beta1,TGF-β1)能減輕MS 的病情[3],但TGF-β1對(duì)MS的作用機(jī)制仍不清楚。本研究參照Mendel造模方法[4]建立慢性EAE模型并給予外源性TGF-β1,擬觀察EAE小鼠病情變化和不同時(shí)期IL-23p19、IL-17和IL-6的動(dòng)態(tài)表達(dá),探討TGF-β1在EAE中可能的作用機(jī)制,以期為MS的臨床治療提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑 72只健康雌性C57BL/6小鼠,清潔級(jí),8～10周,委托中南大學(xué)動(dòng)物學(xué)部代為購(gòu)買。MOG35-55多肽(MEVGWYRSPFSRVVHLY RNGK)由西安美聯(lián)多肽合成有限公司合成(純度＞97%);百日咳毒素購(gòu)自List Biological,Campbell,CA;完全弗氏佐劑購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;小鼠IL-17、IL-23、IL-6 ELISA試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司;小鼠 IL-17、IL-23p19、IL-6及內(nèi)參GAPDH 引物由上海生工技術(shù)有限公司合成。GAPDH:Sense:5′-GCTACAGCTTCACCACA-3′,Anti-sense:5′-ACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3′,產(chǎn)物大小為107 bp;IL-23p19:Sense:5′-CCAAAGGAGGTGGATAGG-3′,Anti-sense:5′-TGTCAGAGTCAAGCAGGT-3′,產(chǎn)物大小為 402 bp;IL-17:Sense:5′-GGCCAAGGACTTCCTCCA-3′,Anti-sense:5′-CAGCTTTCCCTCCGCATT-3′,產(chǎn)物大小為 211 bp;IL-6:Sense:5′-CTGATGCTGGTGACAACCAC-3′Anti-sense:5′-CAGAATTGCCATTGCACAAC-3′,產(chǎn)物大小為175bp。

1.2 EAE模型的建立 72只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為EAE組、佐劑組、干預(yù)組和假干預(yù)組。其中EAE組:以免疫當(dāng)天為第0天,用抗原乳劑200 μ l(由100 μ g MOG35-55、100 μ l完全弗氏佐劑和 100 μ l PBS 組成)皮下注射免疫;第7天以同樣劑量重復(fù)免疫。于免疫當(dāng)天和48小時(shí),每只小鼠經(jīng)腹腔注射百日咳毒素200 ng。佐劑組僅注射完全弗氏佐劑,劑量同EAE組;干預(yù)組在免疫同時(shí)用TGF-β1進(jìn)行干預(yù),具體為0、3、5、6、8、9、11 天多點(diǎn)皮下注射,每只小鼠每次注射 1 μ g TGF-β1;假干預(yù)組,用PBS代替TGF-β1進(jìn)行干預(yù)。

從初次免疫第0天起至第32天實(shí)驗(yàn)終止前,采用盲法,每天2人至少一次在同一時(shí)間按Benson評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[5],對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行臨床評(píng)估。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為:1分:尾部無力或蹣跚步態(tài)伴尾部有力;2分:蹣跚步態(tài)伴尾部無力(共濟(jì)失調(diào));2.5分:共濟(jì)失調(diào)伴部分單肢麻痹;3分:單肢完全麻痹;3.5分:單肢完全麻痹伴另一肢體部分麻痹;4分:雙肢完全麻痹;4.5分:四肢麻痹;5分:死亡。分別在發(fā)病初(16天)、高峰期(22天)、慢性期(32天)處死小鼠,取部分腦組織行HE和Weil氏染色觀察病理改變(圖1)。

1.3 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng) 一步法提取腦組織總RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,行PCR擴(kuò)增,然后進(jìn)行PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳,于Tanon GIS-2020電泳凝膠圖像分析儀中測(cè)量各產(chǎn)物的光密度。PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5分鐘;循環(huán)35次(95℃變性45秒,59℃退火45秒,72℃延伸1分鐘),最后72℃延伸10分鐘。

1.4 酶聯(lián)免疫吸附法 采用雙抗體夾心法ELISA試劑盒檢測(cè)外周靜脈血分離所得血漿中IL-17、IL-23和IL-6的水平,在規(guī)定的有效期內(nèi)嚴(yán)格按說明書操作使用,并判定結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物臨床評(píng)分和體重變化 EAE組在發(fā)病初期毛色發(fā)暗,活動(dòng)減少,反應(yīng)遲鈍,食欲較差,體重明顯減輕,臨床評(píng)分隨著時(shí)間延長(zhǎng)加重,臨床癥狀有多種表現(xiàn),例如:尾部無力,蹣跚步態(tài),雙后肢爬行困難,不能站立,或呈偏癱步態(tài),在原地劃圈樣走動(dòng);在慢性期部分小鼠癥狀稍減輕,活動(dòng)量較前略增加,反應(yīng)仍較遲鈍,體重沒有進(jìn)一步下降。佐劑組小鼠食欲好,形態(tài)活潑,反應(yīng)靈敏,尾部有張力。干預(yù)組小鼠發(fā)病臨床表現(xiàn)基本同EAE組,但發(fā)病時(shí)間提前,高峰期更為嚴(yán)重,而在慢性期更趨向于緩解;假干預(yù)組臨床表現(xiàn)、發(fā)病時(shí)間和嚴(yán)重程度基本同EAE組。具體見圖2、3。

圖1 EAE小鼠腦中病理表現(xiàn)Fig.1 The representation of brain in EAE group

圖2 實(shí)驗(yàn)小鼠臨床評(píng)分變化Fig.2 The variance of clinical scores of experimental mice

圖3 實(shí)驗(yàn)小鼠的體重變化Fig.3 Weight variance of experimental mice

圖4 實(shí)驗(yàn)小鼠各期腦中IL-23p19、IL-17和IL-6的mRNA表達(dá)Fig.4 The expression of IL-23p19,IL-17 and IL-6 mRNA in cerebra of experimental mice during different phase

圖5 實(shí)驗(yàn)小鼠各期外周血漿中IL-23的表達(dá)Fig.5 The expression of IL-23 in the peripheral blood plasma of experimental mice during each phase

表1 實(shí)驗(yàn)小鼠腦中IL-23p19 mRNA的動(dòng)態(tài)表達(dá)(±s)Tab.1 The dynamic expression of IL-23p19 mRNA in cerebra of experimental mice(±s)

表1 實(shí)驗(yàn)小鼠腦中IL-23p19 mRNA的動(dòng)態(tài)表達(dá)(±s)Tab.1 The dynamic expression of IL-23p19 mRNA in cerebra of experimental mice(±s)

Note:1)P＜0.01,vs control group;2)P＜0.05,vs EAE group or notho-intervention group;3)P＜0.05,vs onset.

Groups Onset Peak point Chronic phase Control group 0.166±0.026 0.168±0.032 0.159±0.032 Notho-intervention group 0.715±0.0291) 0.584±0.0251) 0.585±0.0411)EAE group 0.706±0.0181) 0.596±0.0331)3) 0.580±0.0221)Intervention group 0.790±0.0191)2) 0.490±0.0191)2) 0.480±0.0231)2)Note:1)P＜0.01,vs control group;2)P＜0.05,vs EAE group or notho-intervention group;3)P＜0.05,vs onset.表2 實(shí)驗(yàn)小鼠腦中IL-17 mRNA的動(dòng)態(tài)表達(dá)(±s)Tab.2 The dynamic expression of IL-17 mRNA in cerebra of experimental mice( ±s)Groups Onset Peak point Chronic phase Control group 0.142±0.026 0.158±0.012 0.154±0.005 Notho-intervention group 0.611±0.0351) 0.727±0.0251) 0.707±0.0371)EAE group 0.613±0.0291) 0.726±0.0271)3) 0.704±0.0211)Intervention group 0.654±0.0141)2) 0.757±0.0181)2) 0.642±0.0121)2)

表3 實(shí)驗(yàn)小鼠腦中IL-6 mRNA的動(dòng)態(tài)表達(dá)(±s)Tab.3 The dynamic expression of IL-6 mRNA in cerebra of experimental mice(±s)

表3 實(shí)驗(yàn)小鼠腦中IL-6 mRNA的動(dòng)態(tài)表達(dá)(±s)Tab.3 The dynamic expression of IL-6 mRNA in cerebra of experimental mice(±s)

Note:1)P＜0.01),vs control group;2)P＜0.05,vs EAE group or notho-intervention group.

Groups Onset Peak point Chronic phase Control group 0.140±0.018 0.166±0.024 0.153±0.014 Notho-intervention group 0.720±0.0261) 0.718±0.0121) 0.724±0.0281)EAE group 0.728±0.0161) 0.721±0.0281) 0.727±0.0231)Intervention group 0.759±0.0291)2) 0.757±0.0241)2) 0.756±0.0171)2)

圖6 實(shí)驗(yàn)小鼠各期外周血漿中IL-17的表達(dá)Fig.6 The expression of IL-17 in the peripheral blood plasma of experimental mice during each phase

圖7 實(shí)驗(yàn)小鼠各期外周血漿中IL-6的表達(dá)Fig.7 The expression of IL-6 in the peripheral blood plasma of experimental mice during each phase

2.2 RT-PCR結(jié)果 分別計(jì)算IL-23p19/GAPDH、IL-17/GAPDH、IL-6/GAPDH得出各指標(biāo)的光密度相對(duì)值并進(jìn)行比較。

IL-23p19、IL-17和IL-6在各組各期表達(dá)變化具體見表1～3和圖4～7。

3 討論

以前的研究認(rèn)為IL-12在Th1細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病如多發(fā)性硬化中發(fā)揮了關(guān)鍵性的作用,然而新近的研究認(rèn)為,IL-23可能較IL-12在EAE中發(fā)揮著更為關(guān)鍵的作用[6,7]。本實(shí)驗(yàn)中 IL-23在EAE發(fā)病初期表達(dá)即升高,這提示 IL-23可能與EAE的發(fā)病有關(guān)。Thakker等[8]從MOG免疫的小鼠中提取出致病性的T細(xì)胞,注入野生型和 IL-23p19-/-小鼠,兩組均能產(chǎn)生EAE。這提示致病性T細(xì)胞一旦成熟產(chǎn)生,就很少依賴IL-23,即IL-23更可能在疾病的早期發(fā)揮作用,而本實(shí)驗(yàn)中IL-23在高峰期和慢性期表達(dá)下降,這也證明IL-23主要在模型的誘導(dǎo)初期發(fā)揮作用。

IL-17作為Th17細(xì)胞分泌的關(guān)鍵性因子之一,已被發(fā)現(xiàn)在多種自身免疫性疾病中表達(dá)升高。IL-6來源多樣,可以由樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌;其作用復(fù)雜,可在多種途徑多個(gè)水平對(duì)其他細(xì)胞和細(xì)胞因子產(chǎn)生影響。本實(shí)驗(yàn)中,IL-17表達(dá)在發(fā)病初期表達(dá)升高,并在高峰期進(jìn)一步升高,慢性期略有下降,而IL-6在整個(gè)病程均呈高表達(dá),這說明IL-17和IL-6與EAE的發(fā)病密切相關(guān)。Veldhoen等[9]發(fā)現(xiàn)由分枝桿菌誘導(dǎo)的Th17細(xì)胞分化必須依賴TGF-β1和 IL-6存在。Ogura等[10]認(rèn)為在EAE中IL-17可以通過正反饋回路誘導(dǎo)IL-6的產(chǎn)生從而增強(qiáng)自身免疫。Serada等[11]發(fā)現(xiàn)IL-6的缺陷可以抑制EAE中抗原特異性Th17細(xì)胞的產(chǎn)生以及Th1型細(xì)胞免疫,使用IL-6抗體可以抑制EAE的發(fā)病。我們認(rèn)為在EAE的發(fā)病中,IL-6聯(lián)合TGF-β1可以誘導(dǎo)致病性Th17細(xì)胞的分化,后者分泌大量的IL-17并進(jìn)一步誘導(dǎo)IL-6的分泌,后者通過級(jí)聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘的破壞。然而本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)IL-6在EAE各期均呈高表達(dá),且在慢性期IL-17表達(dá)降低時(shí)其表達(dá)依然增高,我們認(rèn)為在發(fā)病初期和高峰期,IL-6的高表達(dá)與IL-17的正反饋有關(guān)[10],而在慢性期IL-6依然呈高表達(dá)可能與慢性期炎癥反應(yīng)的維持有關(guān),這可能存在其他的調(diào)節(jié)機(jī)制,有待進(jìn)一步的研究。

TGF-β1屬于生長(zhǎng)因子超家族,它具有多重調(diào)節(jié)功能。在TGF-β1干預(yù)組中,與EAE組相比,IL-23在發(fā)病初期表達(dá)更高,而在高峰期和慢性期表達(dá)更低;經(jīng)TGF-β1干預(yù)后,EAE小鼠發(fā)病提前,這也支持IL-23可能主要在EAE模型誘導(dǎo)初期發(fā)揮作用的結(jié)論。在干預(yù)組中,IL-17在發(fā)病初期、在高峰期的表達(dá)較EAE組更高,而在慢性期表達(dá)下降;IL-6在整個(gè)病程均呈高表達(dá)。在臨床癥狀上,經(jīng)TGF-β1干預(yù)后的EAE小鼠高峰期癥狀更重,而在慢性期更趨向于緩解,這說明IL-17的表達(dá)與EAE疾病的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn),TGF-β1的免疫調(diào)節(jié)功能呈現(xiàn)劑量依賴性,低濃度時(shí)表現(xiàn)為協(xié)同IL-6誘導(dǎo)Th17細(xì)胞的分化,而在高濃度時(shí)則誘導(dǎo)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的分化,其中前者可以誘導(dǎo)EAE的發(fā)生而后者介導(dǎo)免疫抑制[12]。本實(shí)驗(yàn)中,我們對(duì)干預(yù)組采用多個(gè)時(shí)間點(diǎn)重復(fù)注射TGF-β1,我們認(rèn)為在干預(yù)之初,在低劑量的條件下,TGF-β1的功能主要表現(xiàn)為協(xié)同IL-6誘導(dǎo)Th17的分化,后者分泌IL-17并進(jìn)一步誘導(dǎo)IL-6的高表達(dá);隨著注射劑量累積的增多,TGF-β1的功能又表現(xiàn)為誘導(dǎo)Treg細(xì)胞的分化,這與干預(yù)組小鼠的臨床表現(xiàn)是相符合的。研究發(fā)現(xiàn),IL-23對(duì)于Th17細(xì)胞的存活、增殖以及IL-17的分泌至關(guān)重要[13]。這與本實(shí)驗(yàn)干預(yù)組中發(fā)病初IL-23的表達(dá)上調(diào)以及干預(yù)組小鼠發(fā)病提前、高峰期癥狀更重是相符合的。然而TGF-β1如何影響IL-23的表達(dá),其機(jī)制尚不清楚。

總之,本研究驗(yàn)證了IL-23/Th17細(xì)胞炎癥軸在EAE發(fā)病中的重要性;IL-23在早期的免疫啟動(dòng)中可能發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用;外源性的TGF-β1通過上調(diào)IL-17的表達(dá)使得EAE的發(fā)病提前,高峰期癥狀更重;同時(shí)經(jīng)干預(yù)后,EAE在慢性期更趨向于緩解。我們期望本文能為MS的臨床治療提供指導(dǎo),然而EAE/MS的發(fā)病是多種免疫因子共同作用的結(jié)果,TGF-β1能否用于MS臨床治療,仍需進(jìn)一步的研究。

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