利春葉 吳麗妮 朱肖奇 王愛琴 賈賽雄

(南方醫(yī)科大學(xué)附屬深圳寶安醫(yī)院 廣東深圳 518101)

1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)材料、方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

材料及儀器:新西蘭大白兔90只,雌雄不限,5～7周齡,體重2.5kg左右,其中3只用于提供BMCS以及關(guān)節(jié)滑液來源,其余用于研究防止肌腱粘連。

1.2 研究方法

MSCs的誘導(dǎo)分化:將MSCs移入含地塞米松1×10-7mol/L、關(guān)節(jié)滑液1×10-7mol/L、bFGF-23ng/mL、維生素C100mg/L的胎牛血清DMEM,誘導(dǎo)MSCs向滑膜細(xì)胞分化,通過離心、純化后鑒定(光鏡、透射電鏡以及免疫組化等鑒定)。然后培養(yǎng)擴(kuò)增備用。

滑膜樣細(xì)胞移植:選用84只大白兔,每只兔的右后肢作為實(shí)驗(yàn)組,左后肢為對(duì)照組。將誘導(dǎo)分化的細(xì)胞懸液移植入大白兔右后肢損傷的跟腱處,術(shù)后用管形石膏將下肢固定于膝關(guān)節(jié)屈曲15°,踝關(guān)節(jié)背伸l5°,足趾自然位。

檢測指標(biāo):術(shù)后l、2、4、8周取材。第1周每組各3只動(dòng)物6條跟腱進(jìn)行大體標(biāo)本粘連等級(jí)評(píng)定、組織學(xué)觀察(包括光鏡和透射電鏡觀察);后3周每組各6只動(dòng)物12條跟腱,隨機(jī)取6條跟腱進(jìn)行生物力學(xué)測試,6條進(jìn)行大體標(biāo)本粘連等級(jí)評(píng)定及組織學(xué)觀察。

表1 肌腱粘連分布(等級(jí)資料的秩和檢驗(yàn))

表2 肌腱的斷裂載荷(單位:N)

2 結(jié)果

2.1 滑膜樣細(xì)胞的鑒定

BMSCs傳代培養(yǎng)初期可見大量懸浮細(xì)胞,48h后可見有散在紡錘形貼壁細(xì)胞,經(jīng)多次半量換液后,未貼壁細(xì)胞逐漸被去除。4d后可見成簇、貼壁的紡錘形細(xì)胞逐漸增多,但仍存在混雜細(xì)胞。經(jīng)多次傳代后,細(xì)胞逐漸純化,并且細(xì)胞初期多以集落形式增長,第6代后細(xì)胞呈形態(tài)均一的紡錘形,分布均勻。

在bFGF-2、關(guān)節(jié)滑液等誘導(dǎo)條件下,BMSCs逐漸向滑膜樣細(xì)胞形態(tài)分化。于4d后散在個(gè)別細(xì)胞逐漸呈梭型生長。7d后梭型細(xì)胞較前增多,細(xì)胞間較少見緊密聯(lián)接。10d時(shí)梭型細(xì)胞約占2/3。隨細(xì)胞數(shù)量增加而逐漸紊亂,無明確的方向性排列特征。14d時(shí)長滿培養(yǎng)皿底,細(xì)胞形態(tài)以梭形為主,兩極胞突細(xì)長,末端多與鄰近細(xì)胞連接并交織成網(wǎng)狀。網(wǎng)間散布有較多小星形或多邊形細(xì)胞,與梭形細(xì)胞緊密連接。

貼壁法純化后,擴(kuò)增培養(yǎng),將純化的梭型細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化并吹打制成單細(xì)胞懸液,傳代培養(yǎng)。傳代細(xì)胞在48h內(nèi)貼壁,并很快鋪展。

2.2 大體標(biāo)本屈肌腱粘連等級(jí)評(píng)定

Hitchcock[1]粘連分度法評(píng)估結(jié)果顯示,隨著愈合的發(fā)展,對(duì)照組肌腱粘連逐漸加重,實(shí)驗(yàn)組各時(shí)相粘連等級(jí)基本相當(dāng)。同一時(shí)相點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組同對(duì)照組相比粘連明顯減輕(P＜0.05,見表1)。

2.3 跟腱生物力學(xué)測定

斷裂載荷測試結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較,斷裂載荷有顯著差異(P＜0.05),但與正常屈肌腱的斷裂載荷比較,實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均明顯降低(P＜0.05,見表2)。

3 討論

3.1 骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向滑膜樣細(xì)胞的分化

骨髓基質(zhì)干細(xì)胞是一種可多向分化的細(xì)胞,在特定條件下可分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、心肌細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞等多種細(xì)胞。本研究表明,骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在關(guān)節(jié)滑液和FGF-2誘導(dǎo)下可以分化為滑膜樣細(xì)胞,其具有成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞的組織學(xué)及超微結(jié)構(gòu)特征,并且分化細(xì)胞免疫組化染色Vimentin陽性,CD68陰性。由于巨噬細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞不具有增殖能力,可通過多次傳代去除巨噬細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞而獲得較純的成纖維樣滑膜細(xì)胞[2]。這可能也是本實(shí)驗(yàn)中獲得較純的成纖維樣滑膜細(xì)胞的原因。Vimentin(波形蛋白)是中胚層組織的特征性蛋白,主要存在于成纖維細(xì)胞和來自胚胎間充質(zhì)的細(xì)胞。CD68是巨噬細(xì)胞的表面標(biāo)志,我們用Vimentin及CD68單抗對(duì)培養(yǎng)的第三代滑膜細(xì)胞進(jìn)行了鑒定,結(jié)果與上述文獻(xiàn)相符。

3.2 滑膜樣細(xì)胞移植預(yù)防肌腱粘連

早在1963年,Potenza[3]通過實(shí)驗(yàn)研究認(rèn)識(shí)到保持肌腱滑膜鞘的完整,有利于減輕肌腱愈合過程中的粘連。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的跟腱粘連程度相比,實(shí)驗(yàn)組粘連程度較小,而且從觀察時(shí)相開始到結(jié)束粘連程度相當(dāng),各時(shí)相點(diǎn)比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。此說明移植的細(xì)胞可有效防止肌腱粘連,并且可以促使滑膜形成及愈合,在光鏡及掃描電鏡下可以在肌腱周圍形成一薄層交織成網(wǎng)狀的滑膜樣細(xì)胞層。國內(nèi)張正治等[4]將取自兔的趾腱鞘內(nèi)的滑膜細(xì)胞經(jīng)原代和傳代培養(yǎng)后,制成滑膜細(xì)胞懸液,再與自體無滑膜肌腱段聯(lián)合培養(yǎng)。經(jīng)掃描電鏡觀察,培養(yǎng)后的肌腱表面變得光滑,經(jīng)免疫組化染色vimemtin陽性,說明肌腱表面有滑膜細(xì)胞覆蓋,使之具有滑膜肌腱的形態(tài)學(xué)特征。這是與本實(shí)驗(yàn)相吻合的。

3.3 滑膜樣細(xì)胞移植對(duì)肌腱強(qiáng)度的影響

雖然可以預(yù)防粘連,但肌腱達(dá)不到一定的抗張強(qiáng)度,也是萬萬不行的?；蛹?xì)胞移植后,肌腱的斷裂載荷測試結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組各時(shí)相數(shù)值比較,斷裂載荷有顯著差異,說明實(shí)驗(yàn)組肌腱愈合后生物力學(xué)強(qiáng)度較高。但與正常屈肌腱的斷裂載荷比較,實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均明顯降低。雖然滑膜化肌腱抗張強(qiáng)度仍然達(dá)不到正常水平,但相比無滑膜肌腱有了很大提高。其中肌腱表面之滑膜在一定程度上增強(qiáng)了肌腱的抗張強(qiáng)度,而且滑膜分泌的滑液有營養(yǎng)作用,較之對(duì)照組促進(jìn)了肌腱的更快愈合,也增強(qiáng)了肌腱的抗張強(qiáng)度。

[1]Hitchcock TF,Light TR,Bunch WH,et a1.The effect of immediate constrained digital motion on the strength of flexor tendon repairs in chickens[J].Hand Surg(Am),1987,12(4):590～595.

[2]Tomita T,Nakase T,Kanekom,et al.Expression of extracellular matrix met lop proteins inducer and enhancement of the preduction of matrix metal lop roteinases in rheumatoid arthritis[J].Arthritis Rheum,2002,46(2):373～378.

[3]Potenza AD.Critical evaluation of flexor-tendon healing and adhesion formation within artificial digital sheath[J].J Bone Joint Surg(Am),1963,45(6):1217～1233.

[4]張正治,劉正津,鐘世鎮(zhèn),等.無滑膜肌腱滑膜化的組織工程學(xué)研究[J].生物醫(yī)學(xué)工程雜志，2001，18(1)：1～4.