何英 李春明 單景軍 蔣萍

(黑龍江省哈爾濱市第一醫(yī)院消化科,*病理科,黑龍江 哈爾濱 150010)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)是一類病因不明的胃腸道慢性非特異性炎癥,屬于自身免疫病的一種,近年來(lái)其發(fā)病率不斷增加,已成為消化系統(tǒng)常見(jiàn)疾病和慢性腹瀉的主要病因[1]。目前普遍認(rèn)為該病發(fā)病主要由免疫反應(yīng)介導(dǎo),并與遺傳因素、環(huán)境因素密切相關(guān),免疫調(diào)節(jié)紊亂是本病發(fā)病的關(guān)鍵因素[2-3]。近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)一種新的CD4+輔助T細(xì)胞亞群Th17細(xì)胞亞群,該細(xì)胞亞群主要分泌白介素-17(IL-17)[4]。目前研究[5-6]認(rèn)為Th17細(xì)胞在自身免疫性疾病發(fā)病中起關(guān)鍵性作用。本研究檢測(cè)IL-17在潰瘍性結(jié)腸炎患者中的表達(dá)及其與疾病活動(dòng)指數(shù)的相關(guān)性,探討Th17細(xì)胞在UC發(fā)病機(jī)制中的作用。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 實(shí)驗(yàn)組選擇自2008年1月—2009年10月哈爾濱市第一醫(yī)院25例確診為潰瘍性結(jié)腸炎的門診及住院患者,診斷均符合2007年《對(duì)我國(guó)炎癥性腸病診斷治療規(guī)范的共識(shí)意見(jiàn)》中的診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]。其中男性12例,女性13例,年齡18～70歲,輕度UC患者7例,中度 UC患者14例,重度UC患者4例。對(duì)照組為10例單發(fā)性結(jié)腸或直腸息肉患者,對(duì)照組與UC組的年齡、性別構(gòu)成無(wú)顯著差異(P＞0.05)。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)組在結(jié)腸鏡下選擇病變最顯著腸段的結(jié)腸黏膜3塊活檢,對(duì)照組取距單發(fā)性息肉5 cm以上的正常腸黏膜3塊活檢。另外實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組患者均清晨空腹取外周血。

1.3 主要試劑 IL-17ELISA試劑盒購(gòu)自晶美生物工程有限公司;辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔抗體為武漢博士德公司產(chǎn)品;IL-17抗體購(gòu)自Santa Cruz公司。

1.4 方法

1.4.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法檢測(cè)血清IL-17 分離血清后嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明操作,終止反應(yīng)后在450 nm處讀取各孔吸光度值,以各孔OD值為縱坐標(biāo),以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)樣品OD值查找對(duì)應(yīng)的濃度。

1.4.2 免疫組化檢測(cè)結(jié)腸黏膜IL-17表達(dá) 活檢標(biāo)本常規(guī)甲醛固定,石蠟包埋,并將石蠟塊進(jìn)行連續(xù)切片用于免疫組化檢查。石蠟切片常規(guī)脫蠟進(jìn)水,3%甲醇室溫孵育以清除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性,用0.01 mmol?L-1,pH為6.0枸椽酸鹽緩沖液孵育進(jìn)行熱抗原修復(fù),10%正常羊血清封閉,一抗為兔抗人IL-17抗體(稀釋濃度為1:100),4℃過(guò)夜,滴加生物素標(biāo)記的羊抗兔二抗工作液,37℃溫箱孵育20min,滴加辣根酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素室溫孵育40min,DAB顯色,蘇木素復(fù)染,脫水,透明,封片。每次以PBS緩沖液代替一抗作空白對(duì)照。陽(yáng)性細(xì)胞為細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒沉淀。每張切片均應(yīng)用醫(yī)學(xué)彩色圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描分析,每張切片隨機(jī)取5個(gè)染色較好的不重復(fù)的視野,取其光密度的均值作為該切片的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,留待統(tǒng)計(jì)分析。

1.4.3 疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI)的評(píng)估 每日讓UC患者記錄大便性狀和隱血情況,按表1進(jìn)行評(píng)分。結(jié)腸鏡下黏膜外觀由多名內(nèi)鏡醫(yī)師共同經(jīng)過(guò)盲法閱片,醫(yī)師總體評(píng)價(jià)亦由多名臨床醫(yī)師共同評(píng)價(jià),保證判斷的準(zhǔn)確性。

表1 潰瘍性結(jié)腸炎患者疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI)評(píng)分

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件包進(jìn)行處理,計(jì)量資料采用均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差表示,兩組間比較采用t檢驗(yàn),兩組間相關(guān)分析采用方差分析檢驗(yàn),P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 ELISA法檢測(cè)血清IL-17結(jié)果 25例UC外周血中 IL-17平均濃度為(13.62±2.37)ng?mL-1,10例正常對(duì)照組外周血中IL-17平均濃度為(10.98±3.67)ng?mL,兩組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2.2 免疫組化檢測(cè)結(jié)腸黏膜IL-17表達(dá)結(jié)果 IL-17主要在結(jié)腸黏膜固有層的炎細(xì)胞(如淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞、中性粒細(xì)胞)表達(dá),UC組與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),(圖1)。

圖1 各組患者腸黏膜 LI-17的表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色×100)

2.3 IL-17與疾病活動(dòng)指數(shù)的相關(guān)性 按DAI評(píng)分將UC患者分成輕、中、重3組,IL-17與DAI評(píng)分呈正相關(guān)。IL-17在輕、中、重3組中的表達(dá)分別是15.31%±2.01%;35.43%±3.31%;41.98%±4.65%。輕度與中度UC患者相比,P＜0.05;中度與重度相比,P＜0.05。

3 討 論

UC病因未明,CD4+輔助T細(xì)胞在UC發(fā)病中的作用已經(jīng)得到公認(rèn)[8]。傳統(tǒng)的CD4+輔助性T細(xì)胞主要分為兩個(gè)亞群:Th1細(xì)胞亞群和Th2細(xì)胞亞群。既往人們認(rèn)為Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞失衡是造成UC發(fā)病的主要原因,但是還是有許多令人無(wú)法解釋的現(xiàn)象。Th17細(xì)胞亞群是近幾年才得到肯定的一類CD4+T細(xì)胞亞群,其分泌的主要細(xì)胞因子IL-17能有效地介導(dǎo)中性粒細(xì)胞動(dòng)員的興奮過(guò)程,從而有效地介導(dǎo)了前炎性反應(yīng),誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子、趨化因子和基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá),引起組織細(xì)胞浸潤(rùn)和組織破壞。IL-17可以誘導(dǎo)固有免疫炎癥細(xì)胞因子、急性反應(yīng)蛋白、粒-巨細(xì)胞刺激因子(GCSF)和前列腺素E2等表達(dá),還與炎癥因子腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等有協(xié)同作用,放大加強(qiáng)其致炎效應(yīng)[9]。許多炎性疾病,如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、哮喘及同種排異反應(yīng)患者的病變組織中都能檢測(cè)到IL-17。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明,高水平IL-17與多種自身免疫病發(fā)病機(jī)制有關(guān)[10]。本研究用免疫組化的方法檢測(cè) UC結(jié)腸黏膜IL-17的表達(dá)水平,在UC患者結(jié)腸黏膜中IL-17表達(dá)較正常人顯著增加。Ogawa[11]應(yīng)用抗-CD3或抗-CD68與抗-IL-17進(jìn)行雙重染色,發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞和單核/巨噬細(xì)胞是炎癥性腸疾病患者炎癥局部IL-17的來(lái)源。這與IL-17的生物學(xué)特性一致,因此,可以說(shuō)來(lái)源于T細(xì)胞和單核/巨噬細(xì)胞的IL-17可以誘導(dǎo)并維持UC黏膜炎癥應(yīng)答。并證實(shí)了IL-17表達(dá)與疾病活動(dòng)指數(shù)呈正相關(guān)。局部IL-17濃度的高低也反映了UC的炎癥嚴(yán)重程度。本實(shí)驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)外周血IL-17表達(dá)增高,說(shuō)明Th17細(xì)胞因子主要作用于病變局部而非全身,進(jìn)一步證明了記憶性T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)具有組織器官的靶向性[12]。而IL-17主要由記憶性T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生,某一部位的IL-17升高能誘導(dǎo)相應(yīng)部位的炎性反應(yīng),具有部位的專一性[13]。因此,通過(guò)本實(shí)驗(yàn)可以推測(cè)Th17細(xì)胞與UC發(fā)病有密切關(guān)系。近年來(lái)通過(guò)分子標(biāo)靶技術(shù)阻斷炎癥、免疫途徑治療UC的理念取得了較大進(jìn)展[14-15],局部阻斷 Th17細(xì)胞的分泌可以成為治療UC的一種手段。

1 Ouyang Q,T andon R,Goh KL,et al.The emergence of inflammatory bowel disease in the Asian Pacific region[J].Curr Opin Gastroenterol,2005,21:408-413.

2 Jiang Y,Xia B,Jiang L,et al.Association of CTLA-4 gene microsatellite polymorphism with ulcerative colitis in Chinese patients[J].Inflamm Bowel Dis,2006,12(5):369-373.

3 Vermeire S.Genetic susceptibility and application of genetic tes ing in clinical management of inflammative bowel disease[J].Aliment Pharmacol,2006,3:2-10.

4 Harrington LE,Mangan PR,Weaver CT.Expanding the effector CD4T-cell repertoire of the Th17 lineage[J].Curr Opin Immunol,2006,18(3):349-356.

5 Weaver C T,Harring ton LE.T h17:an effector CD4 T cell lineage with regulatory T cell ties[J].Immunity,2006,24(6):677-688.

6 Harrington LE,Mangan PR,Weaver CT.Expanding the effector CD4 T-cell repertoire:the T h17 lineage[J].Curr Opin Immunol,2006,18(3):349-356.

7 中華醫(yī)學(xué)會(huì)消化病學(xué)分會(huì)炎癥性腸病協(xié)作組.對(duì)我國(guó)炎癥性腸病診斷治療規(guī)范的共識(shí)意見(jiàn)[J].中華消化雜志,2007,27:545-550.

8 龐艷華,鄭長(zhǎng)青.Th 1/T h2細(xì)胞亞群與炎癥性腸病的關(guān)系[J].世界華人消化雜志,2004,12(8):1922-1924.

9 Komiyama YS,Nakae T,M atsuki A,et al.IL-17 plays an important role In the developiment of experimental autoimmunity encephalomyelitis[J].Immunol,2006,177(1):566-573.

10 朱建建,陳靜,黃進(jìn)華.白介素-23與銀屑病的關(guān)系[J].國(guó)際皮膚性病學(xué)雜志,2007,33:177-179.

11 Gawa A,Andoh A,Araki Y.Neutralization of interleukin-17 aggravatedextran sulfatesodium-induced colitis in mice[J].Clin Immunol,2004,110(1):55-58.

12 Avidson NJ,Leach MW,Fort MM,et al.T helper cell 1-type CD4+T cells,but not B cells,mediate colitis in interleukin-10 deficient mice[J].Exp Med,1996,184:241-225.

13 Ossiez F.Interleukin-17[J].Int Rev Immunol,1998,16:541-551.

14 歐陽(yáng)欽.炎癥性腸病的研究策略[J].中華消化雜志,2005,35:385-386.

15 李文波,孫自勤.潰瘍性結(jié)腸炎治療藥物現(xiàn)狀[J].中國(guó)臨床醫(yī)學(xué),2004,11(2):144-147.